秦娟， 宋國林， 王建三, 林虹， 劉卿， 陳錦云， 王嫣**

(1.貴陽市婦幼保健醫(yī)院 婦科， 貴州 貴陽 550003； 2.貴州省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 貴州 貴陽 550003； 3.重慶醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)、化療及放療為主，但患者生存率仍不理想，且這些傳統(tǒng)治療方法對尚未生育的育齡婦女影響較大；因此，尋求無創(chuàng)治療宮頸癌是目前全球的研究熱點(diǎn)[1-2]。目前，超聲治療被認(rèn)為是目前腫瘤治療的一種無創(chuàng)新方法[3]，已應(yīng)用于慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變，甚至宮頸癌[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比較于正常細(xì)胞，低強(qiáng)度超聲更容易誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，特別是惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡更加明顯[5-7]。HeLa腫瘤細(xì)胞株是宮頸癌細(xì)胞中具有代表性的人宮頸癌細(xì)胞，本研究采用低強(qiáng)度超聲輻照對HeLa細(xì)胞進(jìn)行照射、然后繼續(xù)培養(yǎng)，于輻照后6 h及24 h時(shí)，采用Annexin V/PI雙染法檢測HeLa細(xì)胞的凋亡率，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，Western blot測定細(xì)胞勻漿中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-12(Casepase-12)蛋白表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-12蛋白在HeLa細(xì)胞中的陽性表達(dá)率，探討低強(qiáng)度超聲對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，細(xì)胞密度約為5×105時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要儀器 超聲輻照儀(重慶海扶公司生產(chǎn)，超聲功率輸出0.5～5 W/cm2，可連續(xù)輸出，頻率9～10 MHz ，內(nèi)置功率調(diào)節(jié))，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司，倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3主要試劑 高糖DMEM及胎牛血清均購自Gibco公司，CCK-8檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，Anti Caspase-12和生物素標(biāo)記的二抗、內(nèi)參一抗、羊抗兔IgG等均購自美國Abcam公司，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國PIERCE公司，2.5%戊二醛溶液、1%四氯化鋨、丙酮等均購自北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1超聲輻照 將對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為1×109/L，每管2 mL。輻照處理組：超聲探頭固定于細(xì)胞輻照儀器底部，將細(xì)胞懸液放置于細(xì)胞輻照裝置內(nèi)、頻率10 MHz、0.25 W/cm2，輻照10 s。研究設(shè)立對照組(細(xì)胞進(jìn)行假照，輻照時(shí)間、輻照方式同輻照處理組)。

1.2.2細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法檢測，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,用篩選參數(shù)超聲輻照后再置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于輻照后6及12 h收取細(xì)胞懸浮液,1 000 r/min離心5 min，丟棄上清液,加入1×Binding buffer 500 μL、Annexin V-FITC 5 μL及PI 10 μL,輕輕混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3細(xì)胞微結(jié)構(gòu)觀察 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，3 000 r/min離心3 min，丟棄上清液，2%戊二醛固定后進(jìn)行脫水。丟棄去殘余脫水劑，室溫下依次加入丙酮-EPON812包埋劑、純包埋劑進(jìn)行完全包埋，切片、干燥后用醋酸雙氧鈾染色液室溫下染色10 min，鉛染色液室溫下染色12 min，沖洗并用濾紙吸干，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.2.4細(xì)胞勻漿中Caspase-12蛋白水平 采用Western blot法檢測，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)， BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h, 在4℃冰箱中使用一抗(稀釋比例100 ∶1)孵育過夜,常溫下使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵2 h, 加入ECL曝光后進(jìn)行半定量分析。

1.2.5Caspase-12蛋白陽性表達(dá)率 采用免疫組織化學(xué)法檢測，制作細(xì)胞爬片、免疫組織化學(xué)染色前使用0.5%Triton X-100、3% H2O2處理細(xì)胞，PBS漂洗，一抗孵育(稀釋比1 ∶100)4 ℃ 過夜(陰性對照用PBS液代替一抗)，加入二抗工作液37 ℃孵育30 min(Envision 兩步法)，DAB顯色10 min(避光，鏡下觀察至棕色)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡

Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示：與對照組HeLa細(xì)胞凋亡率比較，輻照后6 h時(shí)HeLa細(xì)胞凋亡率(46%)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輻照后24 h時(shí)HeLa細(xì)胞凋亡率(80%)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖1。

2.2 細(xì)胞超微形態(tài)

電鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組(圖2A)比較，輻照后6 h時(shí)HeLa細(xì)胞染色質(zhì)固縮并凝結(jié)成塊、出現(xiàn)凋亡小體(圖2B，白色小框)，輻照后24 h時(shí)的HeLa細(xì)胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松并與胞膜融合，形成空泡(圖2C)。

對照組 輻照6 h 輻照24 h

2.3 細(xì)胞勻漿中Caspase-12 蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，輻照后6 h時(shí)HeLa細(xì)胞勻漿中Caspase-12 蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輻照后24 h時(shí)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖3。

A B

2.4 HeLa細(xì)胞中Caspase-12 蛋白陽性表達(dá)率

結(jié)果顯示，Caspase-12在對照組細(xì)胞中無表達(dá)；在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)主要定位于胞漿，輻照后6及24 h時(shí)HeLa細(xì)胞中Caspase-12 呈陽性表達(dá)，可見胞漿內(nèi)充滿棕黃色顆粒；與對照組比較，輻照后6時(shí)HeLa細(xì)胞中Caspase-12 呈陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)；輻照后24 h更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：與對照組比較，(1)P<0.05, (2)P<0.01。

3 討論

超聲波是一種非電離能量，由于超聲對生物組織細(xì)胞特有的理化作用，其研究前景廣闊。研究表明，超聲可通過多種起始途徑及信號傳導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)多種組織細(xì)胞凋亡。超聲治療已成為當(dāng)今抗腫瘤的研究熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞、病變組織、細(xì)胞較正常細(xì)胞對超聲更為敏感[8-11]。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是超聲治療腫瘤的重要生物學(xué)機(jī)制之一，其應(yīng)用之一是采用低劑量超聲[12]。有研究報(bào)告低能量超聲可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13-15]。且研究表明低能量超聲對不同腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)時(shí)間與劑量有差別[16]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的機(jī)制之一。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜出現(xiàn)膜外翻現(xiàn)象，細(xì)胞皺縮，核固縮及染色質(zhì)凝集，核碎裂、凋亡小體形成等。現(xiàn)大多采用流氏細(xì)胞術(shù)及投射電鏡檢測細(xì)胞凋亡[13,16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同頻率、強(qiáng)度超聲導(dǎo)致細(xì)胞對其有應(yīng)答反應(yīng)，可能與細(xì)胞信號的調(diào)控及傳導(dǎo)有關(guān)。而低強(qiáng)度超聲在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞通透性增加、細(xì)胞結(jié)果改變方面研究也逐漸引起重視。已證實(shí)低頻低強(qiáng)度超聲會因?qū)?xì)胞的空化效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜表面形態(tài)、甚至染色體改變，從而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞[17]。本研究結(jié)果顯示，低強(qiáng)度超聲可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在超聲輻照6 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測到凋亡率為46%，投射電鏡可見凋亡小體。并且隨著時(shí)間延長，凋亡發(fā)生率達(dá)到80%(24 h)。臨床研究表明CINⅠ級患者經(jīng)聚焦超聲治療后3個(gè)月,宮頸局部組織中P16 和Ki-67的表達(dá)都降低，推測可能與凋亡有關(guān)[18]。本研究結(jié)果提示低強(qiáng)度聚焦超聲介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且隨著時(shí)間延長，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

Caspase 家族是細(xì)胞發(fā)生凋亡的常見通路，而既往研究明確的是Caspase-12參與執(zhí)行細(xì)胞凋亡步驟中是起主要作用的分子[19]。 超聲刺激能使人宮頸癌細(xì)胞株存活率下降，既往對其機(jī)制的研究主要集中在依賴于Caspase的凋亡[20]。本研究中超聲處理后用免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-12 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase-12 表達(dá)隨時(shí)間延長呈增加趨勢，提示Caspase-12介導(dǎo)的凋亡信號可能參與了低強(qiáng)度超聲輻照過程。這些結(jié)果暗示Caspase-12 被低強(qiáng)度超聲輻照激活。然而，低強(qiáng)度超聲輻照激活Caspase-12的具體機(jī)制尚不清楚。

超聲對細(xì)胞的超聲——生物學(xué)效應(yīng)包括熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。非熱效應(yīng)包括聲機(jī)械效應(yīng)效應(yīng)，超聲空化、聲化學(xué)效應(yīng)[21-22]。既往研究已證實(shí)改變低強(qiáng)度超聲的各種物理參數(shù)(頻率、時(shí)間及強(qiáng)度)會影響受輻射細(xì)胞的結(jié)果，不同的超聲輻照參數(shù)下對于不同的腫瘤細(xì)胞，發(fā)生的效應(yīng)不同[23-24]。有學(xué)者認(rèn)為低能量超聲誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制可能與空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)有關(guān)[3,11]。本研究采用低強(qiáng)度超聲對細(xì)胞產(chǎn)生非熱生物學(xué)效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與既往研究一致。但低強(qiáng)度超聲波作用的相關(guān)分子信號和關(guān)鍵蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生理生化機(jī)制的仍然是難以捉摸的?？紤]超聲作為外界刺激，可能與低強(qiáng)度超聲輻照激活宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。目前還不清楚超聲誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體途徑。有研究報(bào)道，低強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路被認(rèn)為是與線粒體途徑有關(guān)[25]。因此，課題組下一步工作將考慮研究低強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲輻照可以誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞細(xì)胞凋亡，并通過激活Caspase-12 表達(dá)增加，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。但對于超聲誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡的深入分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步的分析，闡明低強(qiáng)度超聲反應(yīng)影響的分子信號通路。