趙 剛，閆 冰，劉鑫瑩

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞及病毒

ST細(xì)胞（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保存和提供）；病毒（由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備、鑒定和保存）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

新生牛血請（購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 培養(yǎng)基（購自美國Gibco 公司）；Virus Pro?ST-S無血清培養(yǎng)基（購自上海源培生物科技有限公司）；胰蛋白酶（購自美國Sigma 公司）；0.5%豚鼠紅細(xì)胞懸液（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ST細(xì)胞低濃度血清適應(yīng)及馴化

采用逐步降低血清的方法馴化ST 細(xì)胞以適應(yīng)低濃度血清培養(yǎng)，在含10%新生牛血清的MEM 培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的ST 細(xì)胞長至對數(shù)生長中期時，更換為含5%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至80%～90%的匯合度時，胰蛋白酶消化細(xì)胞，以細(xì)胞密度為2.0×105個·mL-1傳代于含5%新生牛血清的MEM培養(yǎng)液中。經(jīng)過5代后，ST細(xì)胞在含5%新生牛血清的MEM 培養(yǎng)液中的存活率維持在95%以上，并保持正常貼壁性能和較快生長速率，可進(jìn)一步降低血清馴化培養(yǎng)。以同樣的方法使ST 細(xì)胞逐步適應(yīng)含1%新生牛血清的MEM培養(yǎng)條件。

1.2.2 懸浮生長ST-S細(xì)胞株篩選

以適應(yīng)1%新生牛血清條件的ST細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，在三角培養(yǎng)瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化適應(yīng)，培養(yǎng)液為1%新生牛血清的ST-S無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞初始接種密度為5.0×105個·mL-1，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為160 r·min-1。每天取樣檢測細(xì)胞密度，從中選出生長旺盛的細(xì)胞擴(kuò)繁保種，命名為ST-S細(xì)胞株。

1.2.3 病毒含量測定

將病毒液用MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液作10 倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-73個稀釋度，各加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個稀釋度6 孔，每孔100 μL，同設(shè)6孔加100 μL MEM作為無病毒空白對照。每孔加入100 μL新消化的ST細(xì)胞懸液（4.0×105個·mL-1），置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每日觀察和記錄各孔中病毒感染情況，取最高細(xì)胞病變時間點(diǎn)，按Reed-Muench法，計算病毒的致半數(shù)細(xì)胞感染滴度（TCID50）。

1.2.4 生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬細(xì)小病毒

將ST-S 細(xì)胞以初始密度0.75×106個·mL-1接種至生物反應(yīng)器，上罐后培養(yǎng)12h，按照MOI（病毒感染復(fù)數(shù)）0.1的比例接種豬細(xì)小病毒L株，接種后72 h 收獲。于7 L 生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)3 批，測定豬細(xì)小病毒L株的病毒含量和紅細(xì)胞凝集價。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 ST細(xì)胞低濃度血清適應(yīng)及馴化

經(jīng)低血清被動懸浮培養(yǎng)適應(yīng)，ST 細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞懸浮生長的形態(tài)，細(xì)胞個體大小基本均一，但細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象嚴(yán)重，個別細(xì)胞團(tuán)較大。在低血清懸浮培養(yǎng)馴化后期，懸浮ST-S 細(xì)胞呈現(xiàn)較好的單細(xì)胞懸浮生長狀態(tài)，細(xì)胞呈圓球形，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象較少，胞體大小基本一致，生長速度正常，說明ST-S 細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了低血清營養(yǎng)條件，成為單細(xì)胞懸浮狀態(tài)生長，見圖1、2。ST-S細(xì)胞不同時間細(xì)胞生長密度見表1。

由表1可知，ST-S細(xì)胞最高生長密度可達(dá)4.5×106個·mL-1。將該懸浮馴化好的ST-S細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)確定為F0代。

2.2 懸浮ST-S細(xì)胞增殖豬細(xì)小病毒

將ST-S 細(xì)胞以初始密度0.75×106個·mL-1接種至生物反應(yīng)器，上罐后培養(yǎng)12h，按照MOI（病毒感染復(fù)數(shù)）0.1的比例接種豬細(xì)小病毒L株，接種后72 h 收獲。于7 L 生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)3 批，測定豬細(xì)小病毒L株的病毒含量和紅細(xì)胞凝集價。結(jié)果表明，工藝參數(shù)穩(wěn)定性較好，病毒含量可穩(wěn)定在107.36～107.60TCID50·mL-1，紅細(xì)胞凝集價在1∶512～1 024，結(jié)果見表2。

圖2 ST-S細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后期

表1 ST-S細(xì)胞不同時間細(xì)胞生長密度

表2 懸浮ST-S細(xì)胞增殖豬細(xì)小病毒

3 討 論

試驗(yàn)中采用逐步降低血清含量并調(diào)整無血清培養(yǎng)基配方的方法，最終可獲得無血清懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞，此株ST細(xì)胞可以穩(wěn)定連續(xù)傳代，細(xì)胞生長可以維持在較高的活力及細(xì)胞密度，從搖瓶放大至7L 反應(yīng)器，細(xì)胞生長穩(wěn)定。本研究掌握了一種ST 懸浮細(xì)胞馴化的方法，其他貼壁細(xì)胞的馴化也可借鑒此類方法。

經(jīng)懸浮馴化的ST-S 細(xì)胞對豬細(xì)小病毒敏感，病毒在其上的增殖能力與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相當(dāng)，可獲得較高的病毒滴度及紅細(xì)胞血凝價；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)豬細(xì)小病毒的操作過程繁瑣、同一批次不同細(xì)胞瓶中病毒的滴度也存在差異、時間成本大。利用ST 懸浮細(xì)胞生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于貼壁培養(yǎng)，且同一批次的病毒質(zhì)量更均一穩(wěn)定，為后續(xù)逐級放大奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本文所述方法馴化的ST 懸浮細(xì)胞呈現(xiàn)較好的單細(xì)胞懸浮生長狀態(tài)，生長速度正常，細(xì)胞最高生長密度可達(dá)4.5×106個·mL-1，以此為基礎(chǔ)制備豬細(xì)小病毒可規(guī)模化快速大量生產(chǎn)，易于質(zhì)量控制，純度高，穩(wěn)定性好，病毒含量可穩(wěn)定在107.36～107.60TCID50·mL-1，紅細(xì)胞凝集價在1∶512～1 024。因此生產(chǎn)工藝可用于豬細(xì)小病毒的大規(guī)模生產(chǎn)。