梁 杰，吳慧敏

（1.張家口市宣化區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 張家口 075000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001）

抗生素是一種以低濃度影響其他生物各項(xiàng)性能的化學(xué)物質(zhì)，是細(xì)菌或其他微生物的代謝產(chǎn)物，也可人工合成。抗生素能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)并殺死細(xì)菌，因此被廣泛應(yīng)用于各方面。在飼料中添加抗生素可以抑制腸道內(nèi)病原體的繁殖生長(zhǎng)，也可以預(yù)防和減少疾病的發(fā)生[1]。但過多添加抗生素會(huì)讓細(xì)菌產(chǎn)生抗性。現(xiàn)如今，濫用抗生素的問題已經(jīng)嚴(yán)重影響并制約畜牧行業(yè)的發(fā)展。畜禽對(duì)疾病的抵抗力大幅降低，致病菌的耐藥性則不斷增強(qiáng)，如果疾病復(fù)發(fā)只能使用級(jí)別更高、更大劑量的抗生素，如此形成惡性循環(huán)，對(duì)畜禽的健康以及畜舍周圍的環(huán)境造成惡劣的影響。而奇異變形桿菌是人獸共患的病原體，近幾年來(lái)臨床上出現(xiàn)許多耐藥菌株并且其耐藥性也逐漸增加，使臨床治療的任務(wù)變的更加艱巨[2]。由于國(guó)內(nèi)與國(guó)際上對(duì)于添加抗生素的要求愈發(fā)嚴(yán)格及大眾認(rèn)識(shí)的日益提高，使得抗生素替代品的研究與開發(fā)越來(lái)越受到科研人員的重視。研究表明，許多中草藥提取物對(duì)抑制奇異變形桿菌生長(zhǎng)都有較好的效果[3]。

綠原酸是一種縮酚酸，由奎尼酸與咖啡酸形成，是植物體有氧呼吸的天然產(chǎn)物，具有生物活性[4-5]。其在高等雙子葉植物和蕨類植物中普遍存在，尤其是金銀花、杜仲等中草藥中含量較高。在對(duì)原材料不造成有害作用的情況下，對(duì)多種腐敗菌都有一定的抑制效果，除此之外還有抗病毒、抗氧化等重要作用[6]。這讓綠原酸成為了備受關(guān)注的防腐添加劑的替代品。

三羥基黃酮是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要成分，主要存在于唇形科植物黃芩的根、紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮中[7]。近十幾年來(lái)，許多研究和文獻(xiàn)都說明三羥基黃酮具有顯著的抑菌效果，以及抗氧化、抗輻射等多種作用，同時(shí)可以調(diào)節(jié)某些疾病，使得黃酮類化合物越來(lái)越受到學(xué)者們的青睞，被認(rèn)為是抗生素替代品的最佳候選者之一。

關(guān)于三羥基黃酮和綠原酸在動(dòng)物飼料添加方面的研究很少，因此，本試驗(yàn)研究綠原酸和三羥基黃酮的抑菌效果和最佳的抑菌濃度，篩選合適的抗生素替代品。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)菌種

奇異變形桿菌（CMCCB 49005）凍干菌粉，購(gòu)于北納微生物細(xì)胞管理中心。

1.1.2 試驗(yàn)材料

綠原酸、三羥基黃銅：市售。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（DSHG-300A）；可見分光光度計(jì)（722 型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE）；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z 型）；潔凈工作臺(tái)（SWCJ-1B）；螺旋振蕩器（QL-861）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）；酶標(biāo)儀（ELx800）；分析天平（BS210S）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺；玻璃培養(yǎng)皿；微波爐；冰箱；96孔板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

在使用潔凈工作臺(tái)時(shí)提前開啟紫外燈30 min進(jìn)行滅菌，進(jìn)入工作臺(tái)前需戴一次性口罩和一次性手套，進(jìn)入后使用75%酒精棉球進(jìn)行手部消毒。試驗(yàn)材料需進(jìn)行高壓滅菌后使用。為盡量減少試驗(yàn)的誤差，所有操作均在工作臺(tái)中完成。

1.2.2 平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基的制備

平板培養(yǎng)基：待上述配置好且已經(jīng)過滅菌后的固體培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃后，在潔凈操作臺(tái)中分別倒入一次性培養(yǎng)皿中，15～20 mL 即可，然后水平放置。

斜面培養(yǎng)基：將上述備用的培養(yǎng)基分別倒入試管中，塞入松緊適宜的棉塞。試管規(guī)格為15×150 mm，其容量為5 mL，倒入培養(yǎng)基的體積約為試管的1/4。將分裝好的試管進(jìn)行滅菌，結(jié)束后等溫度降至50 ℃時(shí)取出。將試管頂端置于高度為1 cm 的物體上，試管內(nèi)的液體會(huì)自然傾斜，凝固之后就制成斜面培養(yǎng)基，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種的活化

在潔凈工作臺(tái)中，使用75%酒精棉球?qū)龈删N管外壁進(jìn)行擦洗消毒，稍干。使用酒精燈將菌種管的上端加熱，用滴管吸取少許液體培養(yǎng)基，滴到菌種管上端加熱處，使得管壁淬火而破裂。在凍干管中加入液體培養(yǎng)基0.5 mL，用移液槍吹吸混勻后全部吸出再注入到液體培養(yǎng)基，搖勻。分別吸取菌混懸液200 μL 于兩平板培養(yǎng)基表面，均勻涂至有阻力感即可。將平板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，溫度設(shè)為37 ℃。

1.2.4 菌種的傳代

采用劃線法把初次活化后的菌種通過接種環(huán)接種到平板上，倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2～3 代。選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落，接種在斜面上，低溫保存。

1.2.5 混懸液的制備

菌種活化后，用接種環(huán)挑取適量菌種于200 mL液體培養(yǎng)基中，在120 r·min-1，37 ℃條件下放入水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)約3 h。制成600 nm處OD值是0.1～0.2，濃度約為105cfu·mL-1的菌混懸液備用。

1.2.6 供液試液的配置

營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基（NA）：準(zhǔn)確稱取固體培養(yǎng)基9.9 g 置于錐形瓶中，倒入蒸餾水300 mL，攪拌至固體溶解后，使用微波爐加熱，煮沸，然后放入121 ℃的滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌，20 min 后取出備用。

營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基（NB）：準(zhǔn)確稱取液體培養(yǎng)基5.4 g 于錐形瓶，倒入300 mL 蒸餾水，攪拌且完全溶解后開始滅菌，步驟同上。

稱取三羥基黃酮、綠原酸各4 g，分別溶于乙醇、丙酮中，得到200 mg·mL-1的藥液，再用相應(yīng)的溶劑對(duì)上述溶液按一定梯度進(jìn)行稀釋，每種藥液得到100、50、10、5、1、0.5 和0.1 mg·mL-17個(gè)濃度梯度的供試藥液?？瞻讓?duì)照為各自相應(yīng)的溶劑。

1.2.7 抑菌活性的測(cè)定

待已滅菌的NA培養(yǎng)基溫度降至約50 ℃，加入體積與1%的培養(yǎng)基相同的試驗(yàn)菌，充分混勻，40 ℃時(shí)倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約30 mL，放入冰箱4 ℃保藏1 h，待其凝固，得到指示菌培養(yǎng)平板。凝固后，用鑷子夾取已滅過菌的牛津杯，在酒精燈上加熱至微熱后，垂直放置在制備好的平板上，每個(gè)平板放3個(gè)即可。等待5～10 min，使牛津杯冷卻，依次在牛津杯中加入不同濃度的藥液40 μL。每個(gè)濃度分別做3 個(gè)重復(fù)，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，有明顯抑菌圈的測(cè)量其大小，并計(jì)算直徑的平均值。直徑越大表明藥液對(duì)細(xì)菌的抑制效果越好。

1.2.8 最低抑菌濃度的測(cè)定（微量肉湯稀釋法）

向96孔板的各個(gè)孔中加入NB液體培養(yǎng)基（第1孔160 μL，第11 孔100 μL，其余各孔為90 μL），使用微量肉湯稀釋法，在第1 孔至第10 孔加入已配制好的供試藥液，11、12 孔不加藥液作為空白對(duì)照（配制藥液濃度為5 mg·mL-1，用移液槍吸取40 μL藥液加入第1孔中，吹吸混勻，再吸出90 μL加入第2孔中。按同樣的方法，依次在前1個(gè)孔混勻后，吸取90 μL 加到后1 個(gè)孔中，直到第10 孔。在第1孔和第10孔混勻后，分別吸取20和90 μL丟棄，使各孔體積分別為90 μL）。而后，在第1～10孔及12 孔中加入濃度為106cfu·mL-1的奇異變形桿菌菌液，第11 孔中不加，此時(shí)每個(gè)孔中的菌的濃度為105cfu·mL-1。每種藥物設(shè)3 個(gè)重復(fù)，并做一組避免藥物顏色干擾的對(duì)照，方法同前幾組相同，只是用生理鹽水代替菌液，以保證體積相同。各孔加好后體積均為100 μL，隨后將96 孔板放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)22 h。然后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，波長(zhǎng)設(shè)定為630 nm，與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算在不同的濃度下細(xì)菌生長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)，再換算為細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)＜20%時(shí)，此濃度即為藥液的最低抑菌濃度。細(xì)菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)和細(xì)菌生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式見式1～2。

細(xì)菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)=（某濃度含藥孔吸光度的OD值-藥物顏色對(duì)照孔OD 值的平均值-無(wú)菌孔OD 值的平均值）/（無(wú)藥細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照孔OD 值的平均值-無(wú)菌孔OD值的平均值） （1）

細(xì)菌生長(zhǎng)抑制率=1-細(xì)菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù) （2）

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果

三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果見表1。

表1 三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果

由表1可知，三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌的抑制效果在試驗(yàn)濃度200 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最佳，抑菌圈的直徑約23.53 mm，在試驗(yàn)濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)效果最弱，抑菌圈直徑約13.36 mm。在濃度為200、100、50 以及20 mg·mL-1時(shí)，抑菌圈直徑均＞20 mm，屬極度敏感；濃度為10、5 mg·mL-1時(shí)，抑菌圈直徑＞15 mm，屬高度敏感；濃度為0.5、0.1 mg·mL-1時(shí)，抑菌圈直徑＞10 mm，屬中度敏感。

2.2 綠原酸對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果

綠原酸對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果見表2。

表2 綠原酸對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果

由表2可知，綠原酸對(duì)奇異變形桿菌生長(zhǎng)的抑制效果隨著試驗(yàn)濃度增加而加強(qiáng)，到200 mg·mL-1時(shí)抑菌圈的直徑為16.74 mm。在濃度為200、100、50 mg·mL-1時(shí)，抑菌圈直徑均＞15 mm，屬高度敏感；其余濃度抑菌圈的直徑均＞10 mm，屬中度敏感。

2.3 兩種藥液對(duì)奇異變形桿菌的最低抑菌濃度

綠原酸溶液和三羥基黃酮溶液對(duì)奇異變形桿菌的MIC的測(cè)定見表3～4。

表3 綠原酸溶液對(duì)奇異變形桿菌的MIC的測(cè)定

表4 三羥基黃酮溶液對(duì)奇異變形桿菌的MIC的測(cè)定

由表3 和表4 可知，綠原酸對(duì)奇異變形桿菌最低的抑菌濃度為0.2 mg·mL-1，三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌最低的抑菌濃度為0.125 mg·mL-1。

3 討 論

研究表明，綠原酸是具有生物抑菌作用的天然防腐劑，也是一些傳統(tǒng)中藥的有效抗菌成分之一。周志娥等認(rèn)為，綠原酸的分子極性較強(qiáng)，對(duì)大分子物質(zhì)的親和力較高，可結(jié)合于細(xì)菌膜表面并使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增大細(xì)胞膜的選擇透過性，破壞細(xì)胞完整性，導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)核苷酸、酶等物質(zhì)部分外泄，從而影響蛋白質(zhì)的合成[8]。陳明光等研究認(rèn)為金銀花的主要成分為綠原酸[9]。謝新芳等利用金銀花不同溶劑提取物對(duì)奇異變形桿菌做了抑菌實(shí)驗(yàn)，乙醇提取物的最低抑菌濃度為15.6 mg·mL-1，藥液濃度為62.5 mg·mL-1時(shí)抑菌圈直徑＞20 mm，水提取物的最低抑菌濃度為31.25 mg·mL-1，藥液濃度在31.3 mg·mL-1出現(xiàn)抑菌圈[10]。上述研究結(jié)果均表明，綠原酸對(duì)奇異變形桿菌具有抑制作用。本試驗(yàn)中最低抑菌濃度為0.2 mg·mL-1，藥液濃度在0.1 mg·mL-1時(shí)有抑菌效果，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)論一致，但數(shù)據(jù)相差較大，原因可能為本試驗(yàn)所用綠原酸純度為45%，不含其他物質(zhì)，而謝新芳等用的是提取液，可能含有其他抑菌類物質(zhì)。

三羥基黃酮作為黃芩的重要組成成分之一，抑菌活性良好。許云華等認(rèn)為，三羥基黃酮的抑菌機(jī)理主要由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定，黃酮芳環(huán)上羥基的位置和個(gè)數(shù)影響了三羥基黃酮的抑菌活性[11]。黃芩作為抗菌藥物應(yīng)用范圍較廣，且對(duì)部分病毒有防治作用。張洺嘉等研究結(jié)果證明，黃芩素對(duì)細(xì)胞膜的形成具有較強(qiáng)的抑制作用[12]。Basile 等研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物對(duì)奇異變形桿菌最低的抑菌濃度是0.016 mg·mL-1[13]。趙香汝等采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了多種中藥對(duì)奇異變形桿菌及其他細(xì)菌的抑制效果，其中黃芩對(duì)奇異變形桿菌的抑菌圈為8 mm，最低抑菌濃度為7.8 mg·mL-1[14]。而本研究結(jié)果顯示，藥液濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)有抑菌效果，抑菌圈的直徑為13.36 mm，最低抑菌濃度為0.125 mg·mL-1，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

綠原酸對(duì)奇異變形桿菌有較好的抑菌效果。在本試驗(yàn)濃度梯度中，濃度為200 mg·mL-1時(shí)效果最好，抑菌圈的直徑為16.74 mm，并且最低抑菌濃度為0.2 mg·mL-1。三羥基黃酮對(duì)奇異變形桿菌有較好的抑菌效果。在本試驗(yàn)濃度梯度中，濃度為200 mg·mL-1時(shí)效果最好，抑菌圈的直徑為23.53 mm，并且最低抑菌濃度為0.125 mg·mL-1。