王莉潔，孫丹，羅春艷

（1.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院健康營(yíng)養(yǎng)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110163；2.沈陽(yáng)眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110163）

人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族（Human Fibroblast growth factors，hFGFs）是一群具有多種生理功能的生長(zhǎng)因子，F(xiàn)GF8（fibroblast growth factor 8）是1992年由Tanaka等[1]在雄性激素依賴(lài)性小鼠乳腺癌SC-3細(xì)胞系中分離出來(lái)的，其在胚胎發(fā)育、血管生成和傷口愈合上，對(duì)組織和細(xì)胞的增殖和分化起著重要作用，是胚胎發(fā)育中不可缺少的生長(zhǎng)因子之一。hFGF8a由233個(gè)氨基酸組成，具有4種亞型：FGF8a、FGF8b、FGF8e和FGF8f[2-4]。近年來(lái)，生物制藥技術(shù)發(fā)展迅猛，引起了國(guó)內(nèi)生物制藥公司的廣泛關(guān)注，生物發(fā)酵方法有助于實(shí)現(xiàn)制藥工藝的標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；陌l(fā)展?；蚬こ讨扑幍目焖侔l(fā)展也開(kāi)發(fā)了一系列針對(duì)疑難雜癥的藥物，通過(guò)生物發(fā)酵技術(shù)開(kāi)拓了藥物生產(chǎn)來(lái)源的供給途徑。目前，F(xiàn)GF具有廣泛的生物學(xué)活性和重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，然而，重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a（recombinant human fibroblast growth factor 8a，rhFGF8a）作為一種新型的治療手段，其生產(chǎn)成本和生物發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性等核心問(wèn)題有待解決，本文以產(chǎn)rhFGF8a多肽的重組大腸埃希菌[5]為研究對(duì)象，考察兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)其工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性、表達(dá)量和產(chǎn)量的影響，為該重組大腸埃希菌在規(guī)模化生產(chǎn)中提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

重組基因工程菌大腸桿菌BL21（Escherichia coli），菌體中含有FGF8a基因，基因來(lái)源于人成纖維細(xì)胞中，由華僑大學(xué)林俊生教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

大豆胨、胰化蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)自O(shè)XIOID公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥試劑公司；卡那霉素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷（簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG），購(gòu)自Inalco公司；純化試劑，購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。

1.3 主要儀器

生物凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司生產(chǎn)；全溫振蕩培養(yǎng)搖床、恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司生產(chǎn)；蛋白電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)；脫色震蕩搖床，北京六一儀器有限公司生產(chǎn)；低溫冷凍離心機(jī)，美國(guó)艾本德公司生產(chǎn)；細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝儀器公司生產(chǎn)；磁力攪拌發(fā)酵罐（50 L），上海保興儀器公司。生產(chǎn)

1.4 主要溶液與培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基1：稱(chēng)取大豆胨90 g、氯化鈉150 g、磷酸氫二鉀75 g、葡萄糖75 g、胰化蛋白胨510 g，加入30 L H2O，待滅菌后冷卻為40 ℃時(shí)加入卡那霉素50 mg/mL儲(chǔ)液（終濃度為50 μg/mL），倒入發(fā)酵罐中121 ℃滅菌30 min，滅菌后降至37 ℃?zhèn)溆?。調(diào)節(jié)pH 7.2。

液體培養(yǎng)基2：稱(chēng)取氯化鈉300 g、酵母提取物150 g、胰化蛋白胨300 g，加入30 L H2O，待滅菌后冷卻為50 ℃時(shí)加入卡那霉素50 mg/mL（終濃度為50 μg/mL），倒入發(fā)酵罐中121 ℃滅菌30 min，滅菌后降至37 ℃?zhèn)溆?。調(diào)節(jié)pH 7.2。

卡那霉素（50 mg/mL）儲(chǔ)液：稱(chēng)取50 g卡那霉素加入1 L H2O溶解，用0.22 μm濾膜，過(guò)濾滅菌后的補(bǔ)料瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

IPTG（1 mmol/L）儲(chǔ)液：稱(chēng)取240 g IPTG粉末加入1 L H2O溶解，用0.22 μm濾膜，過(guò)濾滅菌后的補(bǔ)料瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌種活化

取低溫保藏的甘油菌株50 μL接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過(guò)夜活化。

1.5.2 不同培養(yǎng)基的發(fā)酵人FGF8a重組大腸桿菌種子液生長(zhǎng)曲線(xiàn)

分別選擇1.4中液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2各250 mL，加入卡那霉素（Kanamycin，Kan）100 mg/mL，接入活化后的重組菌液250 μL，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別測(cè)定其生長(zhǎng)情況。

1.5.3 不同培養(yǎng)基中人FGF8a的重組大腸桿菌中發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)與產(chǎn)量測(cè)定

分別取上述不同培養(yǎng)液的重組人FGF8a工程菌種子液，按照1∶50比例分別接入30 L的液體培養(yǎng)基1（含卡那霉素）與液體培養(yǎng)基2（含卡那霉素）中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量20%，采用1 mol/L NaOH與0.5 mol/L HCl全程自動(dòng)控制pH，當(dāng)菌體OD600=0.8時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導(dǎo)16 h，結(jié)束發(fā)酵后，5 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集菌體，加入細(xì)菌裂解液，采用超聲破碎儀進(jìn)行破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，觀察菌體總蛋白與目的蛋白表達(dá)量情況，測(cè)定其hFGF8a產(chǎn)量。同時(shí)，取未加IPTG的菌液作為對(duì)照組。

1.5.4 重組菌中人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a的Western blot鑒定

取相同濃度下液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2發(fā)酵培養(yǎng)后提取的總蛋白溶液，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉30 min，在鼠抗6×HIS抗體中4 ℃孵育過(guò)夜。次日膜進(jìn)行TTBS清洗，在羊抗小鼠IgG-HRP的二抗中孵育1 h，通過(guò)ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光，鑒定hFGF8a，并定量其表達(dá)量，膜采用麗春紅進(jìn)行染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)人FGF8a重組菌的生長(zhǎng)測(cè)定

在培養(yǎng)種子過(guò)程中，液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2中種子菌株均從延滯期開(kāi)始復(fù)蘇，隨后在2 h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，在16 h后進(jìn)入平緩期，如圖1所示。因此，選取16 h后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞活力和質(zhì)粒穩(wěn)定性較強(qiáng)，可縮短發(fā)酵周期，降低成本。

圖1 不同種子液培養(yǎng)基人FGF8a重組菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖1可知，液體1號(hào)培養(yǎng)基與液體2號(hào)培養(yǎng)基在菌株活化與種子液培養(yǎng)上，生長(zhǎng)趨勢(shì)與時(shí)間并無(wú)較大差距。16 h后菌體活力比較液體2號(hào)存在下降趨勢(shì)，兩種培養(yǎng)基均可以用于菌株活化與種子液培養(yǎng)。

2.2 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a的重組菌的表達(dá)

通過(guò)液體1號(hào)培養(yǎng)基與液體2號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的重組菌，用1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16 h后提取菌體總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，兩種培養(yǎng)基在預(yù)期分子量大小位置均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶（圖2），且液體2號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后的重組菌在誘導(dǎo)后rhFGF8a蛋白的表達(dá)明顯。

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵下人FGF8a重組菌的SDS-PAGE分析

2.3 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a的重組菌的Western blot鑒定

經(jīng)過(guò)BSA方法蛋白含量測(cè)定后，調(diào)整不同培養(yǎng)基發(fā)酵誘導(dǎo)后的菌體總蛋白含量，使其保持一致后，經(jīng)Western blot鑒定該蛋白條帶為rhFGF8a（圖3）。由圖3可知，液體2號(hào)培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中重組人FGF8a的表達(dá)量高于液體1號(hào)培養(yǎng)基，因此，選擇液體2號(hào)培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。通過(guò)表達(dá)量計(jì)算得出液體2號(hào)培養(yǎng)基獲得的重組人FGF8a產(chǎn)量在80 mg/L。

圖3 Western blot鑒定重組菌中人FGF8a表達(dá)

3 討論

我國(guó)生物技術(shù)起步較晚，經(jīng)過(guò)近三十年的迅速發(fā)展，生物技術(shù)基礎(chǔ)研究綜合實(shí)力都有了很大的提升，但同發(fā)達(dá)國(guó)家相比差距非常明顯。生物技術(shù)成果轉(zhuǎn)化率低，中試能力及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)水平落后，生物技術(shù)成果大多僅限于基礎(chǔ)研究，停留在實(shí)驗(yàn)室研究水平，不能滿(mǎn)足企業(yè)生產(chǎn)和商品化的需要，這都是制約我國(guó)生物技術(shù)發(fā)展的重要因素。隨著人成纖維生長(zhǎng)因子家族的功能多樣化越來(lái)越受到更多科研人員甚至生物公司的關(guān)注，但在以往的研究中開(kāi)發(fā)的都普遍停留在實(shí)驗(yàn)室搖瓶階段，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的國(guó)內(nèi)公司很少，建立一套簡(jiǎn)單有效的生產(chǎn)工藝，有利于該因子的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程推進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)篩選得到了50 L規(guī)模中試發(fā)酵生產(chǎn)的最優(yōu)培養(yǎng)基，建立了一種重組人FGF8a的表達(dá)生產(chǎn)工藝方案，此外，這種成分簡(jiǎn)單、操作容易、成本低廉的發(fā)酵培養(yǎng)基，為后續(xù)的研發(fā)進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。但后續(xù)對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)下游產(chǎn)品純化與活性鑒定還需要其他學(xué)者進(jìn)一步研究與探討。