楊杰，徐聞，楊正虎，張曉曉，周吟

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

呼腸孤病毒（Reoviridae）屬于雙鏈RNA病毒，基因組通常具有10～12個節(jié)段，可以感染人、禽類、昆蟲等，具有15個屬。有些動物和植物呼腸孤病毒以昆蟲作為傳播載體，但其中只能夠感染昆蟲的呼腸孤病毒包括3個屬的病毒：質(zhì)型多角體病毒屬（Cypovirus，簡稱為CPV）、昆蟲非包涵體病毒屬（Idnoreovirus）以及迪諾維納病毒屬（Dinovernavirus）[1]。這3種昆蟲呼腸孤病毒屬的病毒在結(jié)構(gòu)上各有特點(diǎn)，CPV和其他呼腸孤病毒相比，只具有單層的衣殼蛋白，病毒粒子包裹在包涵體蛋白中。昆蟲非包涵體病毒屬（Idnoreovirus）的病毒和CPV相比，其病毒粒子具有雙層衣殼，并且病毒粒子外圍不具有多角體蛋白包裹。目前發(fā)現(xiàn)的迪諾維納病毒屬（Dinovernavirus）只有兩種病毒：Fako virus（FAKV）和Aedes pseudoscutellarisreovirus（APRV）[2-3]，該病毒屬的病毒和CPV相同之處在于其病毒粒子也只具有單層衣殼蛋白，所不同的地方在于病毒粒子的外圍不具有多角體蛋白。目前對于昆蟲呼腸孤病毒的研究主要集中在單株病毒的鑒定上，針對這3種昆蟲呼腸孤病毒屬在進(jìn)化上是否具有相關(guān)性，目前尚無相關(guān)研究，因此本文對其進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)序列的獲取

從GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）下載質(zhì)型多角體病毒、昆蟲非包涵體病毒屬和迪諾維納病毒屬的代表病毒的所有序列，并且根據(jù)注釋信息截取翻譯RdRp蛋白和大衣殼蛋白的氨基酸序列片段。RdRp的序列比對使用NCBI的BLAST工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為了進(jìn)行RdRp和大衣殼蛋白的進(jìn)化分析，氨基酸序列首先進(jìn)行ClustalW分析，再使用MEGA5軟件根據(jù)最大似然法（Maximum-likelihood，ML），自舉100次進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。評估測試方法選擇Bootstrap，重復(fù)次數(shù)（Replications）設(shè)為100，其他的參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲呼腸孤病毒的RdRp進(jìn)化樹分析

依賴RNA的RNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase，RdRp）是所有的RNA病毒在病毒基因組復(fù)制過程中必需的酶，因此RdRp被認(rèn)為是從事病毒進(jìn)化分析的最佳基因[4]。為了明確昆蟲呼腸孤病毒在所有呼腸孤病毒屬之間的分類地位，選取刺突呼腸孤病毒亞科（Spinareoviruinae）所有9個屬病毒的代表病毒的RdRp氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，包括質(zhì)型多角體病毒屬（Cypovirus）、昆蟲非包涵體病毒屬（Idnoreovirus）、迪諾維納病毒屬（Dinovernavirus）、水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus）、科羅拉多蜱傳熱癥病毒屬（Coltivirus）、斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）、真菌呼腸孤病毒屬（Mycoreovirus）、正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）和水稻病毒屬（Oryzavirus）。

如圖1所示，從系統(tǒng)進(jìn)化樹看，質(zhì)型多角體病毒屬和迪諾維納病毒屬處于同一個分支上，親緣關(guān)系較近，幾乎所有不同的呼腸孤病毒屬均處于不同的進(jìn)化分支，另一種昆蟲呼腸孤病毒屬-昆蟲非包涵體病毒屬則處于單獨(dú)的分支上，和CPV等其他昆蟲呼腸孤病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 呼腸孤病毒科刺突呼腸孤病毒亞科病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 昆蟲呼腸孤病毒的主要衣殼蛋白進(jìn)化樹分析

由于質(zhì)型多角體病毒屬和迪諾維納病毒屬的RdRp蛋白處于進(jìn)化樹的同一個分支中，為了進(jìn)一步確定兩個病毒屬之間的進(jìn)化關(guān)系，使用了主要衣殼蛋白（major capsid protein）的氨基酸序列構(gòu)建最大似然法進(jìn)化樹。如圖2所示，從系統(tǒng)進(jìn)化樹來看，CPV的主要衣殼蛋白分為2個分支，迪諾維納病毒屬的病毒和Dp-CPV1和BmCPV-1處于同一個小分支上，親緣關(guān)系較近，和AmCPV-4等CPV不在同一分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 昆蟲呼腸孤病毒編碼RdRp的基因組節(jié)段末端序列比較

進(jìn)一步比較了三種昆蟲呼腸孤病毒編碼RdRp基因組節(jié)段的5'和3'末端序列，結(jié)果如表1所示，迪諾維納病毒屬的5'末端序列的前4個核苷酸和多種CPV相同，均為AGUU：Choristoneura occidentalis cypovirus 16（CoCPV-16），Inachis io cypovirus 2（IiCPV-2），Orgyia pseudotsugatacypovirus 5（OpCPV-5）；5'末端前3個核苷酸與BmCPV-1、DpCPV-1相同，均為AGU。迪諾維納病毒屬的5'末端氨基酸序列與CPV有較大相似性。

圖2 質(zhì)型多角體病毒和迪諾維納病毒主要衣殼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

表1 部分昆蟲呼腸孤病毒編碼RdRp基因組節(jié)段5'和3'末端序列的特性比較

3 結(jié)論

本研究對昆蟲呼腸孤病毒科的CPV、昆蟲非包涵體病毒、迪諾維納病毒的RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和主要衣殼蛋白（major capsid protein）這兩個基因的進(jìn)化樹以及5'末端序列的分析，結(jié)果顯示CPV和迪諾維納病毒有較近的親緣關(guān)系。迪諾維納病毒屬的FAKV和APRV都是從蚊子的細(xì)胞系中分離得到的，而有一部分CPV也是從蚊子中分離得到的，例如Anopheles cypovirus、Uranotaenia sapphirinacypovirus 17（UsCPV-17）和Culex restuanscypovirus 17（CrCPV-17）[5-7]。除了在遺傳上和宿主上迪諾維納病毒屬和CPV具有相似性以外，它們的病毒粒子的結(jié)構(gòu)也非常類似[2-3]。迪諾維納病毒屬具有9個雙鏈RNA基因組節(jié)段，和其他屬的CPV相比，只是缺少編碼多角體蛋白的基因組節(jié)段。推測對于迪諾維納病毒屬來說，因?yàn)橹皇窃诶ハx細(xì)胞中增殖，并不需要在昆蟲里面增殖，所以編碼多角體的基因組節(jié)段，對于迪諾維納病毒屬來說并不是必需的，因此認(rèn)為迪諾維納病毒屬被分為CPV外的另一個屬可能不恰當(dāng)，它可能應(yīng)該被認(rèn)定為CPV中的亞屬才更為恰當(dāng)。