張 俊，王 勇，張 鋒，王欣悅，王 嬌，趙保堂，楊富民*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.慶陽質(zhì)量檢驗檢測研究院，甘肅 慶陽 745000；3.甘肅省分析測試中心，甘肅 蘭州 730000)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)屬于乳桿菌屬，是一種革蘭氏陽性異型發(fā)酵乳酸菌[1]。副干酪乳桿菌具有平衡腸道菌群、抑菌、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等多種益生特性，其產(chǎn)γ-氨基丁酸性能更吸引人們的關(guān)注[2]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid ，GABA)是一種由4個碳原子構(gòu)成的非蛋白氨基酸[3-4]。其作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血壓、抗驚厥、促進(jìn)精神安定等作用[5-6]，在預(yù)防和治療癲癇、活化腎肝、抗炎等方面具有良好的效果[7-10]。因GABA在天然食物中含量較低，目前主要通過化學(xué)合成法、植物富集法、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA[11-12]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA具有產(chǎn)率高、操作簡便、食用安全、污染小等優(yōu)勢，使其近年來成為關(guān)注與研究熱點[13-15]。研究人員將GABA作為一種新型添加劑應(yīng)用于食品中[16]。目前，提升乳酸菌產(chǎn)GABA含量備受人們的關(guān)注[17]。Li等[18]對乳酸芽孢桿菌NCL912產(chǎn)GABA的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，最終使得GABA的產(chǎn)量達(dá)到了345.83 mmol/L。本研究以從傳統(tǒng)牦牛酸奶中篩選出的具有抗氧化性的副干酪乳桿菌為研究對象，研究其產(chǎn)γ-氨基丁酸的生長條件，旨在為副干酪乳桿菌高產(chǎn)GABA提供依據(jù)，并拓寬該菌株的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌；L-谷氨酸鈉，上海中秦化學(xué)試劑有限公司；GABA標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、檸檬酸混合液、MRS培養(yǎng)基成分；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計UV759(PC)，上海悅豐儀器儀表有限公司；pH計、精密天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速臺式離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司；氨基酸自動分析儀，日本日立LA8080。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

1.3.1.1 MRS培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏8 g/L，硫酸鎂2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，1 mL吐溫-80。

1.3.1.2 初始培養(yǎng)基

酵母浸粉10 g/L，無水乙酸鈉2 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L，維生素B6 2 mmol/L。

1.3.2 樣品前處理

參考竇海艷[19]的方法，菌液靜培72 h。培液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，取上清液后添加10%的三氯乙酸，并以10 000 r/min離心5 min，液體經(jīng)0.22 μm(水相)過濾備用。

1.3.3 培養(yǎng)基單因素試驗

以初始培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，采用比色法測定GABA。碳源選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、麥芽糊精、果糖；氮源選擇蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、酸水解蛋白、大豆蛋白；無機(jī)鹽選擇氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、氯化鈉；前體物質(zhì)(L-谷氨酸鈉)質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 g/L；接種量設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；pH值設(shè)置為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5；溫度設(shè)置為33、35、37、39、41 ℃。

1.3.4 Plackett-Burman與響應(yīng)面法試驗

根據(jù)單因素試驗，選擇碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH值、接種量、溫度、底物濃度，進(jìn)行PB試驗，進(jìn)一步篩選后采用Box-Behnken軟件設(shè)置中心組合實驗，確定培養(yǎng)基的最佳組合。

1.3.5 GABA含量測定

1.3.5.1 比色法測定GABA

參考竇海艷等的研究[19-21]方法并改進(jìn)，取0.4 mL處理液，依次加入0.5 mL硼酸緩沖液(pH=9.0)、1 mL 10%苯酚、0.1 mL碳酸鈉、0.3 mL次氯酸鈉。沸水浴10 min、冰浴20 min后，加2 mL 60%的無水乙醇，混勻后靜置30 min。于640 nm處測定吸光度值。

1.3.5.1.1 苯酚濃度與次氯酸鈉溶液對GABA測定的影響

取5 mmol/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)混合液0.4 mL。分別添加2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%與18%的苯酚，其余測定條件保持不變；添加次氯酸鈉溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1與1.2 mL，其他條件保持不變進(jìn)行測定。

1.3.5.1.2 比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別取0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，其余保持不變，測定640 nm處的吸光值。

1.3.5.1.3 精密度試驗

運用比色法測定2.5 mmol/L GABA和7.5 mmol/L GABA的吸光度。

1.3.5.2 氨基酸自動分析儀法測GABA

采用GB 5009.124-2016中氨基酸的測定原理，并參考日立LA8080的說明書，取2 mL處理好的發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min，10 min離心后取上清液。設(shè)置色譜分析條件[22-24]，用氨基酸自動分析儀進(jìn)行檢測。

1.3.5.2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g GABA超純水溶解為0.001、0.005、0.01、0.015、0.02 mg/mL。

1.3.5.2.2 色譜條件

GABA與茚三酮緩沖液反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，波長測定為570 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

分離柱：4.6 mm ID×60 mm，型號：#26622PH，柱溫50 ℃，檸檬酸緩沖溶液流速為0.40 mL/min。

除氨柱：4.6 mm ID×40 mm，型號：#2650 L，柱溫135 ℃，茚三酮緩沖溶液流速為0.35 mL/min。程序設(shè)定為反應(yīng)時間(30 min)與再生時間(23 min)。具體運行參數(shù)見表1。

表1 氨基酸分析儀洗脫程序

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計和分析，采用Design-Expert 8.0.6處理PB試驗和響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色法測定GABA

2.1.1 苯酚、次氯酸鈉對比色法的影響以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖1(a)可知，隨苯酚濃度上升，吸光值整體也隨之增加。苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時吸光度良好，并與16%差異不大，考慮到成本因素，確定10%的苯酚；由圖1(b)可得，次氯酸鈉量增加，吸光值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。次氯酸鈉的添加量為0.3 mL時，吸光值最大；由圖1(c)可見，GABA標(biāo)準(zhǔn)品含量與其吸光值具有良好的線性方程：Y=0.1963X+0.0518，R2=0.995。

2.1.2 精密度試驗

結(jié)果表明，該方法具有較好的檢測范圍(2.5～7.5 mmol/L)，在試驗范圍內(nèi)有很好的檢測精確度，且具有較好的重現(xiàn)性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5%。因此，可用于發(fā)酵樣品的前期測定工作，并進(jìn)行大批量測定工作。

圖1 比色法中苯酚、次氯酸鈉以及標(biāo)準(zhǔn)曲線

GABA濃度/(mmol/L)檢測濃度/(mmol/L)12345平均值標(biāo)準(zhǔn)差RSD/%2.52.4262.4162.4062.4312.4822.4320.0261.0887.57.3377,4137.4547.3627.3167.3760.0500.684

2.2 培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果

圖2 單因素試驗結(jié)果

由圖2(a)可知，在6種碳源中，葡萄糖對GABA產(chǎn)量的影響最大。葡萄糖作為一種單糖，直接參與細(xì)胞內(nèi)糖代謝，被微生物吸收利用[27]。因此，宜選擇葡萄糖作為該培養(yǎng)基的碳源。

由圖2(b)可知，在5種有機(jī)氮源中，蛋白胨對GABA產(chǎn)量的影響最大，酸水解蛋白胨和大豆蛋白胨影響較小。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素，其價格相對較低。

由圖2(c)可知，5種無機(jī)鹽中，硫酸錳和氯化鈣對GABA產(chǎn)量的影響最大，硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉對GABA產(chǎn)量的影響較小。硫酸錳和氯化鈣是微生物生長重要的微量元素，影響微生物的生長發(fā)育。

由圖2(d)可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加γ-氨基丁酸的產(chǎn)量也隨之升高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到3 g/L時GABA的產(chǎn)量最大。隨著質(zhì)量濃度升高，GABA產(chǎn)量下降，可能是由于菌體內(nèi)外滲透壓差變高，干擾了乳酸菌的新陳代謝，從而導(dǎo)致GABA產(chǎn)量下降，這與Villegas等[16]的研究一致。

由圖2(e)可知，隨著接種量的升高，GABA的產(chǎn)量也逐漸提高，當(dāng)接種量達(dá)到6%時，GABA的產(chǎn)量達(dá)到最大值。隨接種量增加，GABA的產(chǎn)量下降，其原因可能是菌體含量增加，前期營養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，后期菌株的生長以及代謝將受到影響。

由圖2(f)可知，隨著pH值的升高，GABA的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增長后減少的趨勢。pH值為6.0時γ-氨基丁酸的產(chǎn)量最大，宜選擇pH為6作為該培養(yǎng)基的pH值。

由圖2(g)可知，隨著溫度的升高GABA的產(chǎn)量也隨之增加，在37 ℃時，達(dá)到副干酪乳桿菌產(chǎn)GABA的最適溫度，γ-氨基丁酸的產(chǎn)量最大。之后，隨著溫度的升高GABA的產(chǎn)量下降，這是由于過高的溫度不適合菌株生長的緣故。

2.3 PB試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗確定的碳源、氮源、無機(jī)鹽、底物濃度、溫度、pH值和接種量8個因素，采用Plackett-Burman進(jìn)行八因素二水平的實驗設(shè)計，高水平為低水平的1.5倍左右，PB試驗設(shè)計和結(jié)果見表3，PB試驗設(shè)計結(jié)果與方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計和結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計與方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)

由表4可知，在副干酪乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的過程中，α=0.05的顯著水平，接種量、氯化鈣、底物濃度對發(fā)酵液的OD640 nm值影響顯著，其中葡萄糖、pH值對GABA產(chǎn)量的影響為負(fù)效應(yīng)，而蛋白胨、底物質(zhì)量濃度、溫度、接種量、氯化鈣、硫酸鎂對GABA產(chǎn)量的影響為正效應(yīng)，因此接種量、氯化鈣、底物質(zhì)量濃度可作為主要影響因素，進(jìn)行培養(yǎng)基響應(yīng)面的優(yōu)化。參數(shù)方程如下：

Y=0.0293-0.00542A+0.00703B-0.00429C+0.0225D+0.00156E+0.06108 F+4.35 1G+0.341H

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.4.1 GABA氨基酸標(biāo)準(zhǔn)測定

將1.0 mg/mL的GABA標(biāo)品溶液稀釋成0.005、0.01、0.015 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定，以峰面積A對質(zhì)量濃度C(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y=97703X+15.787，R2=0.999 7，線性范圍度為 0.005～0.001 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；檢測標(biāo)品與樣品圖如圖3所示。

圖3 GABA標(biāo)品與樣品出峰圖

2.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

使用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計，進(jìn)行三因素三水平的試驗，優(yōu)化副干酪乳桿菌合成GABA的培養(yǎng)基試驗。各因素水平見表5，實驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗水平和因素

根據(jù)表6的結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和方差分析，得到接種量、氯化鈣、底物濃度3個因素對GABA產(chǎn)量影響的回歸方程：Y=2.86+0.022A+0.043B+0.011C-0.002AB-0.021AC+0.035BC-0.13A2-0.086B2-0.079C2。對回歸模型進(jìn)行方差分析檢驗其顯著性，由表7的結(jié)果可知，模型的P=0.001 4<0.05，失擬項不顯著(P>0.05)，決定系數(shù)R2=0.9426，CV=1.43%，說明該模型顯著、具有良好的擬合性，且該模型對86.89%的響應(yīng)值可以進(jìn)行解釋，實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確度較高。根據(jù)P值大小，可以判斷出A2對GABA的產(chǎn)量有極顯著影響，B、B2和C2對GABA的產(chǎn)量有顯著影響，根據(jù)F值，將3個因素對GABA產(chǎn)量的影響進(jìn)行排序，其結(jié)果為:B>A>C。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 回歸模型的方差分析

注：P<0.001，差異極顯著；P<0.05，差異顯著

接種量、氯化鈣與底物濃度的交互效應(yīng)分析見圖4—6。等差線越密集，則響應(yīng)面圖形坡面越陡峭，說明在一個因素固定不變時，另外2個因素的交互作用對GABA產(chǎn)量的影響越大，反之則影響越小。等高線的中心越近似于橢圓，則交互作用越強(qiáng)；等高線的中心越近似于圓，則交互作用越弱。由圖4—6可知，氯化鈣(B)和底物質(zhì)量濃度(C)和的交互效應(yīng)對GABA產(chǎn)量的影響是比較大的。所以在具體試驗操作中，適當(dāng)調(diào)整接種量和底物濃度有利于GABA含量上升。由圖4—6可得，響應(yīng)面坡面陡峭程度為：AB

圖4 接種量氯化鈣交互作用對GABA產(chǎn)量的影響

圖5 接種量底物質(zhì)量濃度交互作用對GABA產(chǎn)量的影響

圖6 氯化鈣底物質(zhì)量濃度交互作用對GABA產(chǎn)量的影響

2.4.3 響應(yīng)面驗證試驗

通過響應(yīng)面試驗得出最佳接種量為4、氯化鈣1.5、谷氨酸鈉1.5、GABA的含量為2.865 14 g/L。做3次實驗取平均值，最后 GABA產(chǎn)量為(2.86±0.02) g/L。

3 討論

谷氨酸通過谷氨酸脫羧酶(GAD)轉(zhuǎn)化為GABA。GAD是1種依賴于5′-磷酸吡哆醛(PLP)的細(xì)胞內(nèi)酶，它催化L-谷氨酸及其衍生物進(jìn)行脫羧。而L-谷氨酸被位于細(xì)胞膜上面的Glu/GABA反轉(zhuǎn)運蛋白導(dǎo)入細(xì)胞，同時將產(chǎn)生的GABA交換到細(xì)胞外[18]。

研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶是生物合成GABA的關(guān)鍵酶及限速酶[25]。Smith等[26]研究發(fā)現(xiàn)，GAD其在pH值為4～6下酶活性較高，乳酸菌在發(fā)酵代謝中，能降低環(huán)境的pH值，在這種條件下能夠激發(fā)GAD的活性，催發(fā)脫羧反應(yīng)；但是Li等[27]發(fā)現(xiàn)代謝后期菌株分解糖產(chǎn)生大量的低重量分子的有機(jī)酸，導(dǎo)致酸性環(huán)境過低從而不適合細(xì)胞生長。Su等[28]發(fā)現(xiàn)鹽酸吡哆醇作為廉價、穩(wěn)定的PLP前體物質(zhì)，在前期加入2 mmol的鹽酸吡哆醇能夠顯著提高GAD的活性。一方面Cacl2等化學(xué)物質(zhì)可以影響酶的活性，而另一方面碳氮源、溫度與接種量會影響菌體的生長活力，從而影響GABA的產(chǎn)量。

此外，GABA含量的降低可能是由于GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸、半醛和琥珀酸[29]的原因。Streeter等[30]研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的GABA在GABA轉(zhuǎn)氨酶的作用下，形成琥珀酸半醛(SSA)和谷氨酸，隨后在琥珀酸半醛脫氫酶的作用下形成琥珀酸(SA)進(jìn)入三羧酸循環(huán)，從而發(fā)揮作用。Kumar[31]等運用C標(biāo)記法，進(jìn)一步研究表明黑曲霉中的GABA由L-谷氨酸脫羧而來。利用黑曲霉不接受外部供應(yīng)的GABA特性，放射性標(biāo)記谷氨酸鹽的吸收率、某些代謝產(chǎn)物的積累率和GABA代謝反應(yīng)，進(jìn)而估算TCA循環(huán)相關(guān)的流量變化；但是關(guān)于副干酪乳酸菌產(chǎn)GABA的具體生產(chǎn)代謝途徑以及影響因素還有待于更深入探究。

4 結(jié)論

影響副干酪乳桿菌產(chǎn)GABA的關(guān)鍵因素是底物質(zhì)量濃度、氯化鈣、接種量；響應(yīng)面優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)接種量和谷氨酸鈉的交互作用對GABA產(chǎn)量的影響最大。優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：酵母浸粉10 g/L，無水乙酸鈉2 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，L-谷氨酸鈉1.4 g/L，維生素B6 2 mmol/L，氯化鈣1.5 mmol/L，接種量4.1%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基產(chǎn)物比初始培養(yǎng)基的GABA的產(chǎn)量提高了9%。