宋 爽 ，劉 宇 **，高 琪 ，趙 爽 ，王守現(xiàn) ，宋慶港

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；2.北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

DNA甲基化是目前研究較為透徹的表觀遺傳修飾，常發(fā)生在胞嘧啶的第5位碳原子上，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將S -腺苷甲硫氨酸上甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上[1]。作為一種重要并相對(duì)穩(wěn)定的表觀遺傳修飾策略，DNA甲基化通過(guò)穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)、參與基因重組等方式，在原核生物、動(dòng)物、植物等多種生物的基本生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。在真菌中，DNA甲基化可能參與形態(tài)建成、逆境脅迫和次級(jí)代謝過(guò)程，但對(duì)其具體功能研究較少。目前，對(duì)基因組甲基化水平分析手段主要采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)，利用同尾酶HpaⅡ和MspⅡ?qū)CGG序列中的胞嘧啶甲基化反應(yīng)的不同，對(duì)基因組范圍內(nèi)的甲基化狀態(tài)變化進(jìn)行分析[3]。

根據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)香菇總產(chǎn)量為986.51萬(wàn)噸，位居所有食用菌品種之首[4]。香菇為中低溫型變溫結(jié)實(shí)性菇類(lèi)，菌絲最適生長(zhǎng)溫度為24℃～27℃，在生產(chǎn)中如遇到較高的環(huán)境溫度，常會(huì)引起菌絲死亡和菌棒腐爛[5]。由于全球變暖，高溫脅迫已經(jīng)影響到我國(guó)許多地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此耐高溫能力成為食用菌抗逆性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，而食用菌抵御高溫脅迫的機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)有研究報(bào)道了香菇受高溫脅迫后生理響應(yīng)和耐熱相關(guān)基因表達(dá)變化，但關(guān)于香菇高溫條件下基因組表觀遺傳變化還未見(jiàn)報(bào)道[5]。本研究利用MSAP技術(shù)分析了耐高溫和高溫敏感香菇菌株在熱脅迫處理后基因組DNA甲基化水平和甲基化模式變化，為表觀遺傳修飾在香菇逆境應(yīng)答中的作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試材料為課題組前期篩選的耐熱香菇菌株（JZB2102050）和熱敏感香菇菌株（JZB2102030），由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所保存。

1.1.2 引物與試劑

所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA Marker、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅡ， 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)

利用打孔器將活化好的香菇JZB2102050和JZB2102030菌絲體分別定量接種在PDA培養(yǎng)基中心，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，刮取100 mg的菌絲，利用試劑盒提取基因組DNA。25℃恒溫培養(yǎng)9 d的香菇菌絲為對(duì)照組。

1.2.2 基因組MSAP分析

雙酶切：分別用各10 U的HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅡ/EcoRⅠ雙酶切400 ng香菇基因組DNA，酶切體系50 μL，37℃酶切12 h。

接頭連接：2條EcoRⅠ接頭和HpaⅡ/MspⅡ接頭分別等量混合，95℃變性5 min合成雙鏈接頭。連接體系：雙鏈EcoRⅠ（5 pmol·μ L-1）接頭0.5 μL，雙鏈 HpaⅡ /Msp Ⅱ（5 pmol·μ L-1）接頭 5 μL，酶切產(chǎn)物 12 μL，10×T4連接酶 buffer 2 μL，T4連接酶 0.5 μL，16℃連接過(guò)夜。

預(yù)擴(kuò)增：反應(yīng)體系為連接產(chǎn)物2 μ L，10 × Ex Taq Buffer 5 μ L，dNTP 5 μ L，預(yù)擴(kuò)增引物各 1 μ L，Ex Taq酶0.2 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min； 4℃保存。

選擇性擴(kuò)增：將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后作為選擇性擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1，共64對(duì)。反應(yīng)體系為稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，10 × Ex Taq buffer 5 μ L，dNTP 5 μ L，EcoR Ⅰ選擇性擴(kuò)增引物 1 μ L，HpaⅡ/MspⅡ選擇性擴(kuò)增引物1 μ L，Ex Taq酶0.2 μ L，ddH2O 補(bǔ)至 50 μ L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1℃；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染觀察并拍照。CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化，HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅡ/EcoRⅠ酶切均有條帶；Ⅱ型（1，0）表示CCGG位點(diǎn)發(fā)生半甲基化，前者酶切有條帶，后者酶切無(wú)條帶；Ⅲ型（0，1）表示CCGG位點(diǎn)發(fā)生全甲基化，前者酶切無(wú)條帶，后者酶切有條帶；Ⅳ型（0，0）表示兩者酶切均無(wú)條帶，CCGG位點(diǎn)發(fā)生超甲基化。

表1 引物及接頭序列Tab.1 Sequence of primers and adaptors

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化水平變化

采用64對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)高溫脅迫處理及對(duì)照組的香菇JZB2102050和JZB2102030基因組DNA進(jìn)行MSAP分析，見(jiàn)表2。

表2 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化水平Tab.2 DNA methylation level of Lentinula edodes after heat stress

由表2可以看出，耐熱菌株和熱敏感菌株對(duì)照組DNA甲基化比例分別為24.59%和19.50%，高溫脅迫后甲基化比例分別上升了43.22%和27.03%，全甲基化比例分別上升了26.42%和8.69%，說(shuō)明高溫可誘導(dǎo)香菇菌株甲基化水平提高，且耐熱菌株甲基化水平變化大于熱敏感菌株。

2.2 高溫對(duì)香菇基因組DNA甲基化模式變化的影響

進(jìn)一步對(duì)2個(gè)香菇菌株處理組和對(duì)照組的擴(kuò)增條帶帶型變化進(jìn)行分析，歸納為以下13種帶型，其中A型表示處理組與對(duì)照組之間甲基化模式無(wú)變化，B型表示處理組發(fā)生甲基化，C型表示處理組發(fā)生去甲基化，見(jiàn)表3。

表3 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化模式變化Tab.3 Methylation pattern variation of Lentinula edodes after heat stress

由表3可以看出， 擴(kuò)增條帶最多的帶型為A1（1，1/1，1），即處理組與對(duì)照組在該位點(diǎn)未發(fā)生甲基化。在所有甲基化條帶中，耐熱菌株JZB 2102050發(fā)生甲基化和發(fā)生去甲基化條帶比例分別占56.19%和29.20%，熱敏感菌株JZB2102030發(fā)生甲基化和發(fā)生去甲基化條帶比例分別占43.78%和34.56%（見(jiàn)圖1），表明在受到高溫脅迫后，耐熱菌株主要發(fā)生甲基化，而熱敏感菌株主要發(fā)生去甲基化。

圖1 熱敏感菌株JZB2102030發(fā)生甲基化（B5）和去甲基化（C3）位點(diǎn)電泳條帶圖Fig.1 Methylation and demethylation bands of heat-sensitive strain JZB2102030 after heat stress

3 討論

食用菌生長(zhǎng)發(fā)育需要適宜的溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)、光照、pH等條件，在遇到環(huán)境脅迫時(shí)，為保持基因組穩(wěn)定，DNA甲基化模式改變?yōu)闀r(shí)常發(fā)生的生理反應(yīng)。植物在脅迫后甲基化變異研究較多，殷歡等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗在高溫脅迫后葉片甲基化水平提高，曾子入等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫后耐熱蘿卜材料主要發(fā)生去甲基化過(guò)程，而不耐熱材料發(fā)生超甲基化頻率較高，但在食用菌中關(guān)于DNA甲基化在脅迫過(guò)程中的響應(yīng)研究較少。肖冬來(lái)等[6]利用F-MSAP技術(shù)分析了光照對(duì)廣葉繡球菌甲基化的影響，結(jié)果表明，光照可誘導(dǎo)全甲基化率上調(diào)，半甲基化率下調(diào)。藍(lán)麗雯等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抑制靈芝DNA甲基化可促進(jìn)靈芝酸的生物合成，這種作用是通過(guò)提高靈芝酸合成酶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究以香菇耐熱菌株JZB 2102050和熱敏感菌株JZB2102030為材料，研究了菌絲在高溫脅迫前后的DNA甲基化變化，結(jié)果顯示，2個(gè)香菇菌株在脅迫處理后甲基化水平都表現(xiàn)為上升，但耐熱菌株甲基化水平變化大于熱敏感菌株；香菇在受到高溫脅迫后，甲基化和去甲基化同時(shí)發(fā)生，耐熱菌株主要發(fā)生甲基化，而熱敏感菌株主要發(fā)生去甲基化，這對(duì)深入研究脅迫環(huán)境下香菇適應(yīng)性進(jìn)化提供了一定參考。