趙劍超，柴壯，郭詩(shī)萌，劉忠華

研究報(bào)告

豬早期胚胎發(fā)育中基因啟動(dòng)子活性分析

趙劍超，柴壯，郭詩(shī)萌，劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

轉(zhuǎn)錄因子SOX2 (sex determining region Y-box2)在早期胚胎發(fā)育第一次譜系分化以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多能性維持等方面具有重要的作用。但是目前有關(guān)基因啟動(dòng)子的系統(tǒng)研究較少，尤其是在豬()中尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。為系統(tǒng)分析豬基因啟動(dòng)子在早期胚胎中的活性，本研究通過(guò)優(yōu)化顯微注射體系中綠色熒光蛋白表達(dá)載體種類和注射時(shí)間，構(gòu)建了適合豬基因啟動(dòng)子活性分析的參照體系和顯微注射體系；對(duì)豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)簇；針對(duì)上述區(qū)域設(shè)計(jì)并構(gòu)建相應(yīng)的缺失型基因啟動(dòng)子報(bào)告載體，利用建立的顯微注射體系將其導(dǎo)入胚胎，通過(guò)mCherry熒光強(qiáng)度以及qRT-PCR定量分析基因啟動(dòng)子中不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)簇對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果表明，與全長(zhǎng)基因啟動(dòng)子相比，基因翻譯起始位點(diǎn)上游2254~2442 bp區(qū)域缺失后，豬4-細(xì)胞和8-細(xì)胞胚胎中基因啟動(dòng)子活性下降至17.8%，該缺失區(qū)域中僅包含兩個(gè)NF-AT(nuclear factor of activated T cells)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。因此，本研究結(jié)果推測(cè)豬基因啟動(dòng)子中NF-AT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是影響豬早期胚胎基因啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。本研究為揭示豬早期胚胎發(fā)育中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持。

基因；啟動(dòng)子活性；豬

SOX2蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于胚胎、原始生殖細(xì)胞、神經(jīng)元等多種組織與細(xì)胞中。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，基因的表達(dá)是大腦皮層形成和發(fā)育所必需的，同時(shí)也參與指導(dǎo)食道與前胃的形成[1]。此外，基因在多種癌細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞中廣泛表達(dá)[2~4]。近年來(lái)，SOX2轉(zhuǎn)錄因子在早期胚胎發(fā)育和維持干細(xì)胞多能性方面的作用受到廣泛關(guān)注[5~7]。

在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中，第一次譜系分化發(fā)生在囊胚腔形成時(shí)期，胚胎由全能性的卵裂球分化形成多潛能性的滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm, TE)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(inner cell mass, ICM)。然而，關(guān)于第一次譜系分化形成滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的機(jī)制目前尚不清楚。SOX2蛋白作為核心多能性轉(zhuǎn)錄因子之一，在早期胚胎發(fā)育中第一次譜系分化以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多能性維持等方面具有重要的作用[8,9]。2003年，Avilion等[10]證實(shí)小鼠()基因敲除的囊胚中仍存在ICM，但導(dǎo)致其喪失多能性，同時(shí)失去產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的能力。2014年，Wicklow等[11]發(fā)現(xiàn)小鼠中基因的表達(dá)不受CDX2蛋白調(diào)控，且基因在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中特異性表達(dá)并具有重要功能。在豬早期胚胎發(fā)育中，SOX2轉(zhuǎn)錄因子備受關(guān)注。2015年，Liu等[12]研究表明，雖然基因在豬內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中特異性表達(dá)，但表達(dá)模式與小鼠不同：(1)在早期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)前體細(xì)胞中即出現(xiàn)基因特異性表達(dá)，但此時(shí)基因尚未表達(dá)；(2)在囊胚期，滋養(yǎng)層細(xì)胞中基因表達(dá)沉默先于極化的發(fā)生，而小鼠中由于細(xì)胞的極化導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞中基因表達(dá)沉默。表達(dá)模式的差異暗示豬基因表達(dá)上游調(diào)控機(jī)制不同于小鼠。此外，在豬誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)的建系研究中，利用SOX2蛋白在內(nèi)的經(jīng)典4因子對(duì)體細(xì)胞重編程，雖然可以獲得具有一定多能性的iPS細(xì)胞系[13~16]，但豬iPSC同時(shí)具有內(nèi)源基因不激活、外源基因不沉默以及不具嵌合能力等問(wèn)題[17]。同時(shí)，參考小鼠和人胚胎干細(xì)胞系建系的經(jīng)驗(yàn)，至今仍無(wú)法獲得豬胚胎干細(xì)胞系[18,19]。上述研究表明，豬與小鼠、人等多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在差異，建立豬多能性相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

其次，用戶端向傳感器端發(fā)送驗(yàn)證傳感器的身份的請(qǐng)求。用戶端的計(jì)算公式為（9）—（10），其中R1是隨機(jī)數(shù)是時(shí)間戳：

本研究通過(guò)檢測(cè)基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)水平評(píng)價(jià)其啟動(dòng)活性，預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析了各區(qū)域?qū)騿?dòng)子活性的影響，進(jìn)而揭示豬早期胚胎發(fā)育中基因表達(dá)調(diào)控關(guān)鍵因子，為進(jìn)一步研究豬早期胚胎第一次譜系分化以及多能性干細(xì)胞建立提供理論基礎(chǔ)[20]。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體構(gòu)建

本研究所用的質(zhì)粒包括：pEGFP-C1 (Clontech，美國(guó))，pRL-TK (Promega E2241，美國(guó))，F(xiàn)UGW (Addgene 14883，美國(guó))和pLV-mCherry (Addgene 36084，美國(guó))。載體構(gòu)建中片段克隆所用的DNA聚合酶為PrimeSTAR?Max DNA Polymerase (TaKaRa R045A，日本)，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件中退火溫度設(shè)定為58℃，時(shí)間15 s；DNA片段連接所用的試劑盒為NEBuilder?高保真 DNA 組裝克隆試劑盒(NEB E2621S，美國(guó))，引物重復(fù)序列長(zhǎng)度25 bp，20 μL反應(yīng)體系中共加入0.2 pmol DNA片段總量，反應(yīng)時(shí)間15 min。PCR和qRT-PCR所用全部引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

*引物序列中未標(biāo)出用于無(wú)縫克隆的重復(fù)序列。

將質(zhì)粒Sp0、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4與內(nèi)參質(zhì)粒pEGFP-C1以4∶1的比例混合，終濃度為100 ng/μL。對(duì)豬胚胎進(jìn)行注射并培養(yǎng)72 h，以檢測(cè)mCherry以及EGFP蛋白的表達(dá)情況(圖5 A)。結(jié)果顯示，與Sp0注射組相比，Sp1注射組胚胎無(wú)法檢測(cè)到mCherry蛋白信號(hào)；Sp3與Sp4注射組mCherry蛋白信號(hào)顯著下降；而Sp2注射組胚胎mCherry蛋白水平與Sp0注射組無(wú)顯著差異(圖5 B)。進(jìn)一步利用qRT-PCR對(duì)各組胚胎的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，相對(duì)于Sp0注射組胚胎，各組胚胎基因相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的下降，但與熒光檢測(cè)結(jié)果不同的是，Sp3注射組胚胎基因的mRNA表達(dá)水平最低，僅為Sp0注射組的0.18(±0.0034) (圖5 C)。據(jù)此推斷，Sp3質(zhì)粒中缺失的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)簇d3可能為基因啟動(dòng)子活性關(guān)鍵區(qū)域。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，d3中僅包含兩個(gè)NF-AT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)NF-AT轉(zhuǎn)錄因子家族是調(diào)節(jié)豬早期胚胎中基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

顯微操作系統(tǒng)為倒置顯微鏡(Nikon TS-100，日本)、顯微注射系統(tǒng)(Nikon IM-9A，日本)及Femtojet Express定量注射系統(tǒng)(Eppendorf，德國(guó))。取100 μL胚胎操作液(MAN)于平皿中央，并用石蠟油覆蓋后放置于顯微操作儀39℃恒溫工作臺(tái)上，向MAN液滴中加入卵母細(xì)胞準(zhǔn)備注射。將5 μL質(zhì)粒溶液通過(guò)微量上樣槍頭加至注射針內(nèi)進(jìn)行注射操作。注射系統(tǒng)相關(guān)參數(shù)為：注射壓力(Pi)100 hPa、注射時(shí)間(Ti)0.5 s和補(bǔ)償壓力(Pc)40 hPa。顯微鏡下對(duì)豬卵母細(xì)胞進(jìn)行胞質(zhì)注射，注射量約為30 pL/枚。

(1)For high power semiconductor lasers,working current Iop is usually much larger than the threshold current Ith,so in formula(5)Ith has relatively small effect.

以Sp0質(zhì)粒為模板，分別以sox2 pro[1]-p、sox2 pro[2]-p、sox2 pro[3]-p和sox2 pro[4]-p為引物進(jìn)行克隆，將得到的克隆產(chǎn)物直接自連，分別獲得質(zhì)粒Sp1、Sp2、Sp3和Sp4，其特點(diǎn)為：分別缺失相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)簇的基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的mCherry表達(dá)載體。

以豬基因組為模板，利用引物sox2+-p進(jìn)行克??；再以克隆產(chǎn)物為模板，利用引物sox2-p克隆得到翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp片段，即本研究中基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子，命名為sox2 pro 5k。以pLV-mCherry質(zhì)粒為模板，利用引物mCherry-p克隆得到mCherry片段；以pEGFP-C1質(zhì)粒為載體骨架，利用引物C1 line-p克隆得到線性化的載體骨架；將sox2 pro 5k片段、mCherry片段和線性化的載體骨架連接，獲得質(zhì)粒Sp0，其特點(diǎn)為：以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎(chǔ)骨架的5000 bp基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的mCherry表達(dá)載體。

構(gòu)建完成的質(zhì)粒去內(nèi)毒素提取后–20℃保存。

本工作提出的改進(jìn)的模型預(yù)測(cè)直接轉(zhuǎn)矩控制方法,通過(guò)優(yōu)化矢量選擇器得到需要進(jìn)行價(jià)值函數(shù)優(yōu)化控制的3個(gè)電壓矢量,可有效降低模型預(yù)測(cè)直接轉(zhuǎn)矩控制的優(yōu)化計(jì)算量.對(duì)于控制延時(shí)對(duì)系統(tǒng)性能的影響,延時(shí)補(bǔ)償控制能夠顯著減小由控制延時(shí)引起的電流紋波和轉(zhuǎn)矩脈動(dòng).通過(guò)在MPDTC的價(jià)值函數(shù)中加入開(kāi)關(guān)切換次數(shù)的約束,增大開(kāi)關(guān)頻率的權(quán)重因子可降低逆變器的開(kāi)關(guān)頻率,但同時(shí)會(huì)使得電流畸變率有所增加.仿真和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,由全階磁鏈觀測(cè)器得到的磁鏈能夠準(zhǔn)確地跟蹤其給定值,改進(jìn)的MPDTC具有良好的動(dòng)、靜態(tài)性能,并且可以有效降低逆變器的開(kāi)關(guān)頻率.

圖1 報(bào)告質(zhì)粒圖譜

A, B：報(bào)告質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-UBC構(gòu)建圖譜；C~E：pRL-TK質(zhì)粒和pRL-CMV、pRL-UBC報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。

表2 報(bào)告質(zhì)粒信息對(duì)比

1.2 胚胎培養(yǎng)與顯微注射

2.1.1 報(bào)告載體的篩選

以pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，利用引物CMV pro-p和EGFP-p分別克隆得到CMV啟動(dòng)子片段和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)片段；以pRL-TK質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，利用引物pRL line-p克隆得到線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體；將CMV啟動(dòng)子片段、EGFP片段和線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體連接，獲得pRL-CMV質(zhì)粒，將UBC啟動(dòng)子片段、EGFP片段和線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體連接，獲得pRL-UBC質(zhì)粒。其特點(diǎn)為：以pRL-TK質(zhì)粒為基礎(chǔ)骨架的CMV或UBC啟動(dòng)子介導(dǎo)的EGFP表達(dá)載體(圖1，C~E；表2)。

1.3 啟動(dòng)子信息獲取與預(yù)測(cè)

表3 sox2pro 5k片段中預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

1.4 啟動(dòng)子活性分析

2.1.2 注射時(shí)間選擇

2 結(jié)果與分析

2.1 豬胚胎顯微注射體系的建立

從屠宰場(chǎng)收集豬卵巢，在37℃生理鹽水中抽取直徑2~8 mm卵泡。將獲得的卵泡液靜置，棄上清，并用HEPES緩沖液清洗稀釋后，在39℃恒溫工作臺(tái)上借助顯微鏡挑出有3層以上卵丘細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞，50枚一組培養(yǎng)在500 μL預(yù)平衡的成熟培養(yǎng)液(MAT)中，條件為39℃、5%CO2的飽和濕度環(huán)境。避光靜置培養(yǎng)42 h后，將卵母細(xì)胞置于0.5%透明質(zhì)酸酶中震蕩去除卵丘細(xì)胞，在39℃恒溫工作臺(tái)上借助顯微鏡挑出具有第一極體的MII期卵母細(xì)胞。將獲得的MII期卵母細(xì)胞置于細(xì)胞融合液(FM)中排成一列，附加兩次120 V/mm、30 μs的矩形脈沖以完成孤雌激活，之后50枚一組培養(yǎng)在500 μL預(yù)平衡的胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)，條件為39℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境中。

對(duì)豬胚胎顯微注射體系中報(bào)告載體的類型進(jìn)行篩選，以獲得高效表達(dá)外源報(bào)告基因的載體。選擇兩種載體骨架以及兩種廣譜型啟動(dòng)子共計(jì)4種載體作為備選報(bào)告載體，分別是pEGFP-C1、pEGFP-UBC、pRL-CMV和pRL-UBC (圖1)。孤雌激活后4 h用上述4種質(zhì)粒對(duì)胚胎進(jìn)行顯微注射，注射質(zhì)粒濃度為20 ng/μL。觀察EGFP蛋白表達(dá)情況以及胚胎發(fā)育情況(圖2，A和B)。結(jié)果表明，注射pEGFP-C1質(zhì)粒的胚胎EGFP陽(yáng)性率為39.33% (±1.76%)，顯著高于其他組(圖2，C和D)。由于早期胚胎發(fā)育會(huì)受外源DNA濃度的影響，因此又分別選擇20 ng/μL與100 ng/μL濃度的pEGFP-C1進(jìn)行顯微注射。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射濃度提高至100 ng/μL時(shí)，注射胚胎發(fā)育情況與20 ng/μL濃度組無(wú)顯著差異(圖2B)，但EGFP表達(dá)效果更好(圖2，C和D)。因此，在后續(xù)研究中選擇pEGFP-C1質(zhì)粒為內(nèi)參和基本載體骨架，質(zhì)?？倽舛葹?00 ng/μL。

紙飛機(jī)飛得很遠(yuǎn)，再慢慢滑翔下去，安安靜靜地扎在街心花園的草叢里。阮小棉看著它，久久地久久地看，真想自己也和它一樣，那么輕那么輕，可以滑翔，墜地的時(shí)候沒(méi)有一點(diǎn)聲響。

為了確定豬胚胎顯微注射體系中最佳注射時(shí)間，分別針對(duì)孤雌前卵母細(xì)胞(–0 h)與孤雌激活0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h以及11 h后胚胎顯微注射pEGFP-C1質(zhì)粒，觀察各組胚胎發(fā)育與EGFP蛋白表達(dá)情況(圖3)。結(jié)果表明，不同注射時(shí)間對(duì)于胚胎發(fā)育與EGFP蛋白表達(dá)影響較大。其中–0 h組對(duì)胚胎發(fā)育影響最小，但EGFP蛋白表達(dá)水平最低；而2 h、4 h與6 h組對(duì)胚胎發(fā)育影響較小，同時(shí)EGFP蛋白高水平表達(dá)(圖3，A和B)。綜合胚胎發(fā)育情況及EGFP蛋白表達(dá)水平，選擇孤雌后2~6 h作為最佳注射時(shí)間。此外，觀察發(fā)現(xiàn)胚胎在4-細(xì)胞期開(kāi)始表達(dá)EGFP蛋白，在8-細(xì)胞期EGFP蛋白表達(dá)陽(yáng)性胚胎比例達(dá)到最高。因此，在后續(xù)基因啟動(dòng)子活性檢測(cè)研究中選擇孤雌后72 h收集4-細(xì)胞和8-細(xì)胞胚胎進(jìn)行檢測(cè)(圖3 C)。

2.2 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析與報(bào)告載體構(gòu)建

本研究對(duì)豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)成簇分布于4個(gè)區(qū)域，以與翻譯起始位點(diǎn)的距離分別命名d1~d4(圖4 A，表3)。針對(duì)4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)簇分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建相應(yīng)缺失的基因啟動(dòng)子報(bào)告載體，將構(gòu)建的啟動(dòng)子片段分別命名為sox2 pro [1~4]，構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為Sp1~4 (圖4，B和C)。同時(shí)針對(duì)豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp序列，與小鼠進(jìn)行相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，序列相似點(diǎn)的排布近似斜率為1的直線，相似性為71% (圖4 D)。因此，小鼠的相關(guān)研究結(jié)果在豬中具有一定參考價(jià)值。

圖2 4種質(zhì)粒對(duì)胚胎熒光標(biāo)記的效果

A：用4種質(zhì)粒分別對(duì)孤雌激活4 h后的胚胎進(jìn)行注射，培養(yǎng)5 d后熒光鏡下觀察基因表達(dá)情況；B：以孤雌胚胎為對(duì)照，各注射組培養(yǎng)5 d內(nèi)胚胎各階段發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)；C：各注射組在培養(yǎng)5 d后胚胎基因表達(dá)陽(yáng)性率；D：各注射組在培養(yǎng)5 d后胚胎EGFP平均熒光強(qiáng)度。括號(hào)中20和100分別代表質(zhì)粒濃度為20 ng/μL和100 ng/μL。

2.3 啟動(dòng)子活性檢測(cè)

以FUGW質(zhì)粒為模板，利用引物UBC pro-p克隆得到泛素C (ubiquitin-C, UBC)啟動(dòng)子片段；以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，利用引物pEGFP line-p克隆得到線性化的pEGFP-C1質(zhì)粒載體；將UBC啟動(dòng)子片段和線性化的pEGFP-C1質(zhì)粒載體連接，獲得pEGFP-UBC質(zhì)粒。pEGFP-C1和pEGFP-UBC質(zhì)粒特點(diǎn)：以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎(chǔ)骨架的CMV (cytomegalovirus)或UBC啟動(dòng)子介導(dǎo)的EGFP表達(dá)載體(圖1，A和B；表2)。

圖3 孤雌激活前后不同注射時(shí)間的熒光標(biāo)記效果

A：分別在孤雌前(–0 h)和孤雌后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、11 h注射pEGFP-C1質(zhì)粒，培養(yǎng)6 d后觀察基因表達(dá)情況；B：各注射組胚胎基因表達(dá)陽(yáng)性率及發(fā)育率統(tǒng)計(jì)；C：2 h、4 h和6 h注射組在培養(yǎng)6 d時(shí)間內(nèi)胚胎各階段發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)。

3 討論

SOX2蛋白是哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，對(duì)于基因上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究可以揭示早期胚胎發(fā)育中細(xì)胞命運(yùn)決定、胚胎干細(xì)胞多能性維持等相關(guān)分子機(jī)制[21]。本研究通過(guò)對(duì)豬早期胚胎中基因啟動(dòng)子活性分析，發(fā)現(xiàn)NF-AT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是4-細(xì)胞與8-細(xì)胞胚胎中調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵順式調(diào)控元件。NF-AT是一個(gè)鈣離子敏感的轉(zhuǎn)錄因子家族，在內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)元等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)[22]。但是NF-AT轉(zhuǎn)錄因子在早期胚胎發(fā)育中的作用功能尚不明確，同時(shí)NF-AT蛋白調(diào)控基因表達(dá)的相關(guān)研究尚未報(bào)道。因此，研究NF-AT轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于豬早期胚胎發(fā)育的調(diào)控功能具有重要意義。

對(duì)Sp1注射組的報(bào)告基因檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其蛋白水平與mRNA水平并不一致。在小鼠中，基因啟動(dòng)子無(wú)“TATA box”核心啟動(dòng)元件，而上游約60 bp處存在倒轉(zhuǎn)的“CCAAT box”元件[23,24]，該元件作為基因啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)元件，轉(zhuǎn)錄因子NF-Y (nuclear factor-Y)可識(shí)別、結(jié)合“CCAAT box”并募集RNA聚合酶復(fù)合體，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn) 錄[25~27]。而Sp1質(zhì)粒中sox2 pro [1]啟動(dòng)子片段缺失區(qū)域d1上存在預(yù)測(cè)的NF-Y結(jié)合位點(diǎn)，且與翻譯起始位點(diǎn)的距離同小鼠類似，因此推測(cè)d1中包含核心啟動(dòng)元件以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。然而本研究結(jié)果顯示，Sp1注射組中可以檢測(cè)到報(bào)告基因的mRNA表達(dá)。據(jù)此推斷，在基因啟動(dòng)子的其他區(qū)域中存在第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，由于sox2 pro[1]中并未破壞第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，導(dǎo)致該組中檢測(cè)到報(bào)告基因的mRNA表達(dá)，但由于移碼突變產(chǎn)生的無(wú)義蛋白不具有熒光特性，因此無(wú)法檢測(cè)到報(bào)告基因蛋白。預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示d2區(qū)域包括C/EBP (CCAAT-en-hancer-binding protein)結(jié)合位點(diǎn)，而C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族具有募集RNA聚合酶復(fù)合體、啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力[28~30]，因此推測(cè)第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于d2中。在后續(xù)研究中，本課題組將針對(duì)這兩個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行分析，明確豬基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)特性。

這幾年，城市就像氣球，不斷膨脹。老城之外，又衍生出新城。車多了，人也多了，老城的路跟不上時(shí)代了，城市的機(jī)關(guān)單位就得挪出去，搬到城市的外圍。路修得寬寬的，向北京的長(zhǎng)安街看齊，生怕再過(guò)幾年又落后了。嗅覺(jué)靈敏的開(kāi)發(fā)商早瞅準(zhǔn)時(shí)機(jī)，在新城的四周豎起一幢又一幢樓盤(pán)。

2007年，為提高服務(wù)業(yè)整體發(fā)展水平和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，更好發(fā)揮標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)服務(wù)業(yè)發(fā)展的促進(jìn)作用，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委積極探索服務(wù)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有效實(shí)施的途徑，創(chuàng)新服務(wù)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化工作的機(jī)制和模式，與國(guó)家發(fā)展和改革委員會(huì)等六部委聯(lián)合下發(fā)《關(guān)于推進(jìn)服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)化試點(diǎn)工作的意見(jiàn)》[1]，在全國(guó)范圍內(nèi)，全面啟動(dòng)了服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)化試點(diǎn)建設(shè)工作，涉及旅游、物流、金融、運(yùn)輸、社區(qū)、餐飲、商貿(mào)及家政等領(lǐng)域。

圖4 豬SOX2翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp序列結(jié)構(gòu)分析

A：豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp序列預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(紅色條)以及4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)成簇分布的區(qū)域d1~d4；B：豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp全長(zhǎng)啟動(dòng)子、4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)成簇分布的區(qū)域d1~d4和構(gòu)建的各區(qū)域缺失型啟動(dòng)子sox2 pro [1~4]；C：基因啟動(dòng)子報(bào)告載體圖譜；D：豬翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp序列與小鼠對(duì)應(yīng)序列相似性比較。

根據(jù)上述結(jié)果以及相關(guān)分析，可以確定調(diào)控基因啟動(dòng)子的潛在關(guān)鍵因子包括NF-AT[31]、NF-Y[32]、C/EBP[33]和AP-2 rep (Krueppel-like factor 12) 4種轉(zhuǎn)錄因子[34]。Cao等[35]對(duì)豬早期胚胎發(fā)育表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上述4種轉(zhuǎn)錄因子在早期胚胎發(fā)育中都有表達(dá)。其中，NF-Y和C/EBP轉(zhuǎn)錄因子可能與豬基因的轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)；NF-AT轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性；而AP-2 rep轉(zhuǎn)錄因子或?qū)F-AT轉(zhuǎn)錄因子的功能產(chǎn)生影響[36,37]。因此推斷這4類轉(zhuǎn)錄因子是潛在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。

圖5 各啟動(dòng)子片段的活性分析

A：孤雌胚胎分別注射Sp0~4各組質(zhì)粒并培養(yǎng)72 h后在熒光鏡下觀察和基因表達(dá)情況（Bar=100 μm）；B：孤雌胚胎注射并培養(yǎng)72 h后各注射組基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)；C：孤雌胚胎注射并培養(yǎng)72 h后qRT-PCR檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量。

雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)[38]雖然是啟動(dòng)子活性檢測(cè)的常規(guī)技術(shù)[39]，然而受到早期胚胎樣品收集困難以及細(xì)胞數(shù)低的制約，本研究無(wú)法采用雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行基因啟動(dòng)子活性評(píng)價(jià)。因此選擇報(bào)告基因表達(dá)水平檢測(cè)的方式評(píng)價(jià)啟動(dòng)子活性[40]。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)報(bào)告基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，避免蛋白降解周期對(duì)結(jié)果的干擾；利用內(nèi)參質(zhì)粒的表達(dá)水平檢測(cè)，排除顯微注射體系的系統(tǒng)誤差；利用內(nèi)源基因的表達(dá)水平檢測(cè)，排除各組間因胚胎狀態(tài)差異導(dǎo)致的誤差，通過(guò)計(jì)算獲得報(bào)告基因相對(duì)表達(dá)水平可以最高程度地體現(xiàn)相應(yīng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，本研究對(duì)胚胎顯微注射條件進(jìn)行探索，最終確定孤雌激活2~6 h進(jìn)行顯微注射可以在保證報(bào)告基因表達(dá)的前提下最小限度地影響胚胎發(fā)育。本研究技術(shù)體系可以更廣泛地應(yīng)用于豬早期胚胎中啟動(dòng)子活性的研究，篩選分析豬早期胚胎中相關(guān)基因調(diào)控元件，揭示豬早期胚胎發(fā)育特點(diǎn)。

從H在2017年工資與福利發(fā)放表中可以查出H 2017計(jì)提工資薪金2 026 830 003.08元，實(shí)際發(fā)放只有1 918 170 240.84元。兩者之間差了108 659 762.2元。只能扣除在規(guī)定限額內(nèi)的實(shí)際發(fā)放的工資和薪金，其余均不能扣除。所以，在最終環(huán)節(jié)，計(jì)算最終應(yīng)納稅費(fèi)的稅基時(shí)，H應(yīng)先對(duì)多計(jì)提并計(jì)入相關(guān)成本費(fèi)用的部分進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)增。調(diào)增數(shù)額為108 659 762.2元，還需補(bǔ)繳稅款 108 659 762.2×25%=27 164 940.55 元。 所以在籌劃時(shí)應(yīng)盡量縮小實(shí)發(fā)與計(jì)提之間的差額。

綜上所述，本研究利用報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)的方法，以pEGFP-C1質(zhì)粒為內(nèi)參和啟動(dòng)子報(bào)告載體骨架，對(duì)孤雌后2~4 h胚胎注射，并在72 h后檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)水平，評(píng)估啟動(dòng)子活性。分析豬基因翻譯起始位點(diǎn)上游5000 bp，發(fā)現(xiàn)4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)成簇分布的區(qū)域，類似于小鼠基因表達(dá)調(diào)控中超級(jí)增強(qiáng)子(super-enhancer)結(jié)構(gòu)[41,42]。通過(guò)分析這4個(gè)區(qū)域?qū)ωi基因啟動(dòng)子活性的影響，發(fā)現(xiàn)存在NF-TA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)簇的關(guān)鍵區(qū)域，該區(qū)域的缺失導(dǎo)致基因啟動(dòng)子活性降低。本研究結(jié)果為豬基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)以及上游調(diào)控機(jī)制的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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Analysis ofgene promoter activity in porcine early embryonic development

Jianchao Zhao, Zhuang Chai, Shimeng Guo, Zhonghua Liu

SOX2 (sex determining region Y-box2) is one of the critical pluripotent factors that play a crucial role in the first lineage differentiation and maintenance of pluripotency in inner cell mass during early embryonic development. However, there are few researches about the regulation of thepromoter, especially in. To analyzed the activity ofpromoter in early porcine embryos, we determined the control system and established the microinjection system for assessingpromoter activity by analyzing the embryonic development and the expression of enhanced green fluorescence protein (EGFP) after micro-injected different EGFP plasmids at different times after activation of the oocytes. Then, we analyzed the structure of 5000 bp upstream of thetranslation initiation site and found there were four transcription factor binding site clusters. Next, we designed and constructed promoter-containing plasmids to analyze the function of each cluster. To detect the activity of different promoters, we assessed the mCherry expression in protein levels and mRNA levels by analyzing the mCherry fluorescence intensity and qRT-PCR after injecting plasmids into embryos. These results showed that the activity of the shorted promoter, with the region from 2254 bp to 2442 bp upstream of translation initiation site deleted, decreased to 17.8% at 4-cell and 8-cell stages compared with the full-length promoter. This region included two NF-AT transcription factor binding sites, which indicated that the NF-AT binding site is a key region to regulate the activity of thepromoter. The results provide important data for determination the mechanism of porcineregulation.

gene; promoter activity; pig

2019-02-21;

2019-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31872360)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31872360)]

趙劍超，碩士研究生，專業(yè)方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: arabidopsis@yeah.net

劉忠華，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：早期胚胎發(fā)育與豬干細(xì)胞研究。E-mail: liuzhonghua@neau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-045

2019/7/5 14:07:50

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190705.1407.002.html

(責(zé)任編委: 李明洲)