羅賢強(qiáng)，陳如章，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325006)

肺癌是發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤[1]。香煙煙霧中存在多種致癌物，其中苯并芘是最為明確且典型的完全致癌物，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸入致癌物的第一組[2]。苯并芘在環(huán)境中分布廣泛，主要存在于煤炭、石油等礦石燃料不完全燃燒產(chǎn)生的煙氣和香煙煙霧中，人類每天通過吸煙或被污染的空氣、食物、水等途徑攝入一定量的苯并芘[2]。

苯并芘常用于在動(dòng)物模型中誘發(fā)肺相關(guān)腫瘤，而這些腫瘤與人原發(fā)性肺癌在組織病理學(xué)特征上極為相似[3]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射苯并芘的劑量與吸煙者一生中所暴露的苯并芘劑量相當(dāng)[4]，在苯并芘給藥后相對較短時(shí)間內(nèi)，隨著年齡的增長，小鼠自發(fā)性長出大量腫瘤[5]。因此，小鼠模型已廣泛用于苯并芘致肺癌作用及其干預(yù)研究[6]。

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)階段和步驟的過程[7]。研究表明，肺慢性炎癥是環(huán)境致癌物導(dǎo)致肺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[8-9]。苯并芘可通過氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)肺持續(xù)高表達(dá)腫瘤壞死因子α(TNF-α)，促使肺部慢性炎癥的形成與維持，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌[2,10]。因此，該研究擬在苯并芘誘導(dǎo)的肺慢性炎癥階段通過阻斷TNF-α的表達(dá)，來改善肺局部炎癥微環(huán)境，從而達(dá)到預(yù)防甚至延緩肺癌的發(fā)生發(fā)展的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡SPF級雄性昆明小鼠購于北京聯(lián)合利華，引進(jìn)飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重(60±5)g。苯并芘、玉米油購自Sigma公司，流式抗體Pacifice Blue anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD11b、PE-cy7 anti-mouse F4/80、PE anti-mouse CD86等購自BioLegend公司，小鼠組織細(xì)胞消化試劑Collagenase IV、DNase I購自Sigma公司，β-巰基乙醇、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。治療用TNF-α拮抗劑為安佰諾，購自浙江海正藥業(yè)。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建

將小鼠隨機(jī)分為苯并芘暴露組與溶劑(玉米油)對照組。處理組小鼠經(jīng)右側(cè)胸腔肋間隙注射苯并芘(苯并芘溶于玉米油)，每周注射1次，每次1 mg·只-1，連續(xù)注射4周。溶劑對照組小鼠注射相同劑量玉米油，每周注射1次，連續(xù)注射4周。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

在小鼠苯并芘暴露第31天，將暴露小鼠隨機(jī)分成2組，每組10只?？筎NF-α(anti-TNFα)治療組小鼠經(jīng)腹腔給藥0.5 mg TNF-α拮抗劑，連續(xù)注射1周；治療對照組小鼠腹腔注射等質(zhì)量PBS，連續(xù)注射1周。在苯并芘暴露180 d后處死小鼠，稱重并采樣以供檢測。

1.3 樣品測定

1.3.1 小鼠肺組織形態(tài)觀察

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石膏包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化，比較炎癥細(xì)胞浸潤程度及腫瘤細(xì)胞浸潤情況。

1.3.2 小鼠肺組織巨噬細(xì)胞及共刺激分子表達(dá)

將小鼠肺組織取出，研磨消化制成單細(xì)胞懸液，200目尼龍膜過濾，流式抗體染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培養(yǎng)基清洗3次，用含細(xì)胞死活染料7-AAD的2% FBS buffer重懸，流式上機(jī)檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)用Flowjo軟件分析，用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肺組織形態(tài)

如圖1所示，PBS治療對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)內(nèi)多量炎性細(xì)胞浸潤并出現(xiàn)腺樣結(jié)構(gòu)；抗-TNF-α處理小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少；溶劑對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯改變。

A—溶劑對照組；B—PBS治療對照組；C—抗-TNF-α處理組。圖1 小鼠肺組織切片(400×)

2.2 小鼠肺組織巨噬細(xì)胞浸潤情況

大多數(shù)腫瘤的發(fā)生與遷延不愈的炎癥緊密相關(guān)，局部慢性炎癥微環(huán)境能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。如圖2所示，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬細(xì)胞浸潤明顯增加。抗TNF-α治療可減少其肺部浸潤，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)，可能是由于檢測樣本是整個(gè)右肺消化成的單個(gè)細(xì)胞樣本，無法體現(xiàn)局部炎癥微小差異。

A—溶劑對照組；B—PBS治療對照組；C—抗-TNF-α處理組。圖2 不同處理小鼠肺組織巨噬細(xì)胞的流式散點(diǎn)圖

圖3 不同處理小鼠肺部巨噬細(xì)胞水平

2.3 小鼠肺組織巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)水平

炎癥不僅上調(diào)APC細(xì)胞膜上MHCⅡ分子的表達(dá)，并能穩(wěn)定膜上MHCⅡ-抗原復(fù)合物[12-13]。如圖4所示，苯并芘暴露小鼠肺部CD86陽性與CD86/MHCⅡ雙陽巨噬細(xì)胞比例均顯著增高，抗TNF-α治療能不同程度降低巨噬細(xì)胞CD86與MHCⅡ的表達(dá)，表明抗TNF-α治療減少了肺部炎癥刺激因子的產(chǎn)生，改善了肺部炎癥微環(huán)境。

3 討論

介導(dǎo)促進(jìn)慢性炎癥的因素同時(shí)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,13]。炎癥是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及免疫和非免疫細(xì)胞之間的相互作用，慢性炎癥為癌癥提供了重要的致癌環(huán)境[13]。苯并芘是香煙中最為明確和典型的重要致肺癌化合物。苯并芘易被吸收，能通過呼吸道、口腔和皮膚等途徑進(jìn)入人體，是吸煙及大氣污染的主要致癌物之一[2]。苯并芘可以直接作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括小鼠、大鼠)，直觀地展現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的各種細(xì)胞分子事件[6]。

A—各處理小鼠肺部CD86陽性巨噬細(xì)胞散點(diǎn)圖與CD86陽性巨噬細(xì)胞占比；B—各處理小鼠CD86/MHCⅡ雙陽性巨噬細(xì)胞流式散點(diǎn)圖與CD86/MHCⅡ雙陽巨噬細(xì)胞占比。圖4 不同處理小鼠肺部炎癥細(xì)胞共刺激分子表達(dá)水平

TNF-α表達(dá)持續(xù)上調(diào)對苯并芘誘導(dǎo)的肺慢性炎癥形成與維持，以及肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用[2]。TNF-α是調(diào)節(jié)炎癥的主要因子，也是確保組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵參與者[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，TNF拮抗劑可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[15]。本研究中，與溶劑對照組小鼠相比，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬細(xì)胞浸潤程度顯著增加，而經(jīng)抗TNF-α治療后肺部巨噬細(xì)胞浸潤程度整體有所下降。在炎癥因子的刺激下，炎癥細(xì)胞表面共刺激分子CD86與MHCⅡ類分子表達(dá)上調(diào)[16-17]。苯并芘暴露小鼠與正常小鼠相比，肺部巨噬細(xì)胞MHCⅡ與CD86表達(dá)水平上調(diào)，經(jīng)抗TNF-α治療后，細(xì)胞表面MHCⅡ與CD86表達(dá)不同程度地降低?？筎NF-α治療可改善苯并芘誘導(dǎo)的肺局部炎癥狀況，并且延緩了肺組織病理改變。以上研究結(jié)果為預(yù)防環(huán)境致癌物暴露誘發(fā)的肺癌提供了初步研究基礎(chǔ)。