劉亞洲 ,張 翠，孫一丁*,楊 奕,李 銣,盧 紅,郭怡卿*

(1.云南農業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223)

【研究意義】“化感作用”(Allelopathy)是指植物(包括微生物)通過其本身產(chǎn)生并釋放到周圍環(huán)境中的化學物質對另一種植物(或微生物)產(chǎn)生直接或間接的相互排斥或促進的效應，是對環(huán)境的一種適應機制和對逆境的防御機制[1]。提高農作物的抗逆性是高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要基礎,也是減少化學品投入、保護生態(tài)環(huán)境的重要保障。作物化感抗性品種的選育可提高其自身種質的抗逆性、提高生物防治效率,是減少化學品投入、保護生態(tài)環(huán)境的根本措施[2]。以減少產(chǎn)量損失為目標的抗性育種(抗逆境、抗病蟲害等)是水稻育種的重要目標之一。水稻化感抗性為這一回標的實現(xiàn)提供了新的途徑?！厩叭搜芯窟M展】水稻化感的研究始于20世紀80年代中后期，美國科學家Dilday等對種質資源庫所收集的12 000份水稻進行了抑草評價，發(fā)現(xiàn)大約3 %的種質材料具有化感抗雜草潛力[3-6]。水稻化感現(xiàn)象引起各國科學家的興趣，紛紛開展了水稻化感抗性種質評價、化感物質分離與鑒定、抗性遺傳性等方面的研究并取得重要進展[7-9]。相關研究表明，酚酸類化合物是重要的化感物質[1-4]。與非化感水稻相比，化感水稻能夠通過其分泌的酚酸類化感物質介導而影響根際微生物活性，同時抑制雜草生長；逆境引起的水稻化感作用增強，導致了合成酚酸類物質的基因表達增強以及釋放到根際土壤中的該類物質量增多[11-13]。苯丙烷途徑是植物化感物質代謝合成中的重要途徑，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)又是酚酸類物質代謝的關鍵酶[14]。C4H在植物中多以小基因家族的形式存在，不同物種間基因數(shù)量不同[15]，以應對植物體復雜的生理調控[16]。水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)作為重要的化學信號，能激活很多防衛(wèi)反應[17-19]，內源與外源的SA、JA均有誘導植物的獲得性抗性的作用，如水稻抗病性[20]以及耐冷與抗旱等生物和非生物脅迫抗性[21-23]。何海斌等通過MeSA和MeJA處理化感水稻IAC165和非化感水稻華粳秈，發(fā)現(xiàn)2種水稻的化感潛力得到增強，酚酸類化合物分泌增多，相關酶活性也發(fā)生改變[24]?！颈狙芯壳腥朦c】水稻中有4個編碼C4H的P450基因[25]，分別是Os01g0820000(CYP73A35)，Os02g0467000(CYP73A39)，Os02g0467600(CYP73A40)和Os05g0320700(CYP73A38)，在化感與非化感水稻材料中這些基因的表達是否存在差異及其與化感潛力的關系，是明確水稻化感抗性機制的重要基礎?！緮M解決的關鍵問題】本研究以化感水稻PI312777及非化感水稻Lemont為研究對象，采用SA和JA處理，q-PCR(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction，簡稱q-PCR)分析4個C4H基因的表達差異，同時通過水浸提液生物測定的方法測定2種水稻化感潛力的變化，以期望發(fā)現(xiàn)這4個基因與水稻化感潛力的相關性，揭示酚酸類物質與水稻化感潛力發(fā)揮的內在分子機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用化感水稻PI312777(PI)和非化感水稻Lemont(Le)[3]作為供體植物，以稗草作為受體植物。稗草種子為上一年度田間采集。同時配制濃度為100 mM的SA，濃度為200 mM的JA備用。

1.2 實驗設計

化感水稻PI312777(PI)和非化感水稻Lemont(Le)分別用JA和SA處理，其中，處理Le(CK)，未經(jīng)處理的Lemont；處理Le(JA)，經(jīng)過茉莉酸處理的Lemont；處理Le(SA)，經(jīng)過水楊酸處理的Lemont；處理PI(CK)，未經(jīng)處理的PI312777；處理PI(JA)，經(jīng)過茉莉酸處理的PI312777；處理PI(SA)，經(jīng)過水楊酸處理的PI312777。

1.3 實時熒光定量分析

育苗及前處理：在育苗穴盤中填充育苗基質，分別播種化感與非化感水稻材料，在溫室中生長到3～4葉期，分別將100 mM的SA和200 mM的JA用噴壺均勻噴灑到2種水稻的葉面上，分別放置于光照培養(yǎng)箱中，25 ℃，12 h光/暗培養(yǎng)。在處理后1、3、24 h分別剪取水稻葉片并立即放入液氮，隨后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提?。阂驯４娴牟煌幚硭救~片采用普洛麥格試劑盒(Eastep?Super)提取RNA，按說明書操作，并采用微量紫外分光光度儀測量RNA的含量。

反轉錄：上述提取的RNA采用普洛麥格(GoScriptTMReverse Transcription System)第一鏈合成試劑盒20 μl體系進行反轉錄獲得cDNA。

引物設計：用肌動蛋白β-Actin作為內參引物，同時在NCBI上設計4個基因的擴增引物見表1，由北京碩擎生物公司昆明分部合成，ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀進行q-PCR分析各基因的相對表達量。

q-PCR分析：采用上海生工SGExcel FastSYBR Mlxture(With ROX)20 μl體系。即上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，Mix 10 μl，RNase-free ddH2O 8.2 μl，模板RNA 1 μl。q-PCR 程序設定為 95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸20 s，45個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃ 15 s，基因相對表達量按照 2-ΔΔCt法計算，基因的相對表達量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt(未脅迫)-ΔCt(脅迫)，ΔCt(樣本)=Ct(目標基因)-Ct(參照基因)。

表1 4個C4H基因q-PCR引物

1.4 化感潛力分析

采用葉片水浸提液[24-25]方法進行，水浸提液是一種常用的評估水稻化感潛力的室內生物測試法。分別取經(jīng)SA、JA處理48 h后相同部位的水稻葉片0.5 g，剪成0.2 cm左右大小的小段，加入5 mL滅菌蒸餾水4 ℃下浸提24 h，用滅菌過濾器濾出獲得水浸提液。將稗草種子用質量分數(shù)為6 %次氯酸鈉表面消毒，滅菌水清洗后均勻播種在培養(yǎng)皿中，萌發(fā)至露白，轉移到含有2 %的瓊脂培養(yǎng)基上，根部向下，每皿20粒，封蓋后將該培養(yǎng)皿放置在25 ℃的光照培養(yǎng)箱內，12 h光/暗垂直培養(yǎng)2 d，選留主根長0.5～1 cm的植株，將上述獲得的水浸提液每皿10株，用微量移液器分別處理稗草的根尖部分，每植株10 μl，待處理部位干后將培養(yǎng)皿再次封蓋放回培養(yǎng)箱培育3 d，測量稗草的主根長度，計算根長抑制率IR評價化感潛力變化。試驗在無菌條件下進行操作，最大限度地控制了微生物的干擾和微生物對化合物的分解直接處理受體植物生長點(根尖)，使試驗所需要的水浸提液的量減少，適合于試驗材料稀少的情況采用。IR的計算公式如下：

IR= (1-Tr/ck) × 100

式中,Tr表示處理組受體植物稗草的生長量測定值，ck表示對照組稗草的生長量測定值，IR表示供體植物水稻對受體植物稗草的影響作用，當IR<0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草的作用為刺激生長；當IR>0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草具有抑制作用；當IR=0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草沒有活性或表示2種植物間無化感作用存在。

圖1 PI312777(PI)和Lemont(Le)在JA和SA激素處理下Os01g0820000的相對表達量

2 結果與分析

2.1 C4H基因相對表達分析

2.1.1 Os01g0820000基因相對表達量分析 JA處理后該基因相對表達量在1、3和24 h 化感和非化感水稻中均呈明顯的降低趨勢；SA處理后Lemont中該基因相對表達量在1和3 h降低，而24 h則出現(xiàn)微微的升高，PI312777中的相對表達量也與Lemont類似，但PI的表達量較Le的稍高(圖1)。這一結果表明該基因在不同化感潛力的水稻中表達相似，對誘導信號具有相似的反應模式。

2.1.2 Os02g0467000基因相對表達量分析 如圖2所示，JA處理后的該基因的相對表達量在2種水稻中，均會呈現(xiàn)出先降后升然后接近正常水平，不同的是在PI312777中，該基因在處理后的3 h相對表達量出現(xiàn)上調，而在Lemont中該基因則在24 h時才出現(xiàn)上調。但經(jīng)SA處理的Lemont該基因相對表達量在1 h有較明顯的升高，在3 h表現(xiàn)為下調，而在PI312777該基因相對表達量在1 h下調，在3 h表達量上調(圖2)。試驗結果顯示，在化感水稻PI312777中，該基因在應對JA處理時，反應要更快。而SA處理后的2種水稻中，該基因在Lemont中反應要快于PI312777。2種水稻面對處理不同處理，均有不同的表達模式，但是結果相似。

圖2 PI312777(PI)和Lemont(Le)在JA和SA激素處理下Os02g0467000的相對表達量

圖3 PI312777(PI)和Lemont9(Le)在JA和SA激素處理下的Os02g0467600相對表達量

2.1.3 Os02g0467600基因相對表達量分析 經(jīng)過JA處理后該基因相對表達量在化感和非化感水稻中均先上調后下調，且在3 h時出現(xiàn)較高程度的上調；而經(jīng)過SA處理的該基因在2種水稻中的表達量在所測量的時間段內均出現(xiàn)上調，且在化感水稻PI312777中3 h時，相對表達量上調幅度較大。從該基因相對表達量可以看出來，面對SA和JA的脅迫，2種水稻的該基因均表現(xiàn)出一定的上調以應對外源激素的脅迫，不同的是化感水稻PI312777的該基因的相對表達要高于非化感水稻Lemont，說明該基因在PI312777中面臨脅迫時，更多的是參與到了肉桂酸-4-羥化酶的合成(圖3)。

2.1.4 Os05g0320700基因相對表達量分析 經(jīng)過JA和SA處理后，非化感水稻Lemont在1、3和24 h時該基因的相對表達量均表現(xiàn)出下調。而經(jīng)過JA和SA處理后的化感水稻PI312777的該基因相對表達量均出現(xiàn)先下調后上調的情況，不同的是經(jīng)過JA處理的PI312777在3 h表達量出現(xiàn)上調，而經(jīng)過SA處理的該基因相對表達量在24 h才出現(xiàn)上調(圖4)。說明該基因在2種水稻中表達差異較大，在化感水稻中表達量要高于非化感水稻。

圖4 PI312777(PI)和Lemont(Le)在JA和SA激素處理下Os05g0320700相對表達量

2.2 水浸提液化感潛力分析

JA和SA處理后水稻葉片水浸提液對稗草根生長的生物測定表明，Lemont的抑制率較未處理的分別提高了22 %和18 %；而PI312777的提高了40 %和28 %，結果表明，JA和SA處理均使2種水稻的化感潛力得到增強，JA的誘導作用高于SA，且PI312777增強均高于Lemont(表2)。

3 討 論

茉莉酸以及水楊酸作為植物體內重要的化學信號，它們均能通過提高植物體內相關酶活性等來提高植物抗逆性[27-30]。水稻化感是對環(huán)境的一種適應機制和對逆境的防御機制，經(jīng)過外源水楊酸和茉莉酸誘導后，體內相關酶活性會發(fā)生變化以應對脅迫。有研究表明，水稻在受到脅迫時，相關基因相對表達量在24 h內差異較大，而超過48 h相對表達量差異不顯著；植物體內酚酸類物質在脅迫后48 h積累量達到最高[31]。因此本研究選擇的時間范圍在處理后24 h以內，同時還檢測了處理后不同基因早期1、3 h的表達量變化。

為研究PI312777和Lemont 2種水稻的浸提液對稗草根長的影響，利用生測法對2種水稻的水浸提液進行檢測。結果表明，SA、JA誘導處理提高了化感抗耐稗草的作用。而4個C4H基因在PI312777和Lemont中相對表達量存在一定差異，其中差異較大的是Os02g0467600和Os05g0320700。Os02g0467600受SA和JA誘導時，PI312777中應答更早，相對表達量的上調程度也要高于Lemont；Os05g0320700在Lemont中一直處于下調狀態(tài)，而該基因相對表達量在PI312777中則均出現(xiàn)先下調后上調。Os01g0820000和Os02g0467000表達模式相似，差異不顯著。因此推測Os02g0467600和Os05g0320700這2個基因是造成這2種水稻化感潛力不同的重要因素。

表2 水稻葉片水浸提液對稗草生長的影響

通過對模式植物擬南芥的類比分析發(fā)現(xiàn)[32]，擬南芥中只有1個C4H基因CYP73A5，而通過突變體材料的研究發(fā)現(xiàn)，突變體植株的表型出現(xiàn)矮化，以及雄性不育、酶不穩(wěn)定等癥狀，突變體的木質素含量明顯下降，肉桂酸酯積累量增多等，說明該基因在擬南芥中受不同的轉錄因子調控而影響到下游基因的表達及生物體的生長發(fā)育等。通過SA和JA處理的2種水稻的化感潛力增強，但基因的表達情況卻不同，說明這4個基因在水稻中分別有不同的表達模式。通過對2種水稻4個C4H基因的CDs克隆分析，發(fā)現(xiàn)4個基因的序列差異極小。為了揭示2種水稻化感潛力不同的原因，對化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont啟動子進行了分析，發(fā)現(xiàn)與非化感水稻Lemont相比，化感水稻PI312777中有多個MYB類、bHLH類、WRKY類轉錄因子表達量上調(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。假設引起2種水稻化感潛力不同的原因是由轉錄因子引起的，因此，通過對調控化感水稻的轉錄因子進行克隆和功能鑒定，比較其在化感和非化感水稻中的表達情況，可進一步明確這4個基因在化感及非化感水稻中表達差異的原因，從而可進一步揭示水稻化感抗雜草的分子機制。

4 結 論

經(jīng)過茉莉酸和水楊酸處理的化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont葉片水浸提液對稗草根生長有顯著的化感抑制效應的增強。本研究表明，經(jīng)過水楊酸和茉莉酸處理后，肉桂酸-4-羥化酶的4個編碼基因差異表達，化感的潛力變化可能與此有關，進一步研究分析發(fā)現(xiàn)差異表達的原因與啟動子有關。