黃鳳璋 覃玉花 梁鳴*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院腎內(nèi)科; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,廣東 廣州 510180)

腎小管間質(zhì)纖維化常表現(xiàn)為小管萎縮和擴(kuò)張、間質(zhì)白細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞聚集以及間質(zhì)基質(zhì)沉積等[1]。EMT是一種固有的上皮標(biāo)記物丟失而獲得間質(zhì)特征的現(xiàn)象，可根據(jù)其發(fā)生的生物環(huán)境被細(xì)分為三類(1型、2型和3型)，其中2型EMT與纖維化有關(guān)，在腎臟中可以發(fā)生在腎小球的足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)。TGF-β1已經(jīng)被證明是EMT的最佳觸發(fā)劑，也最強(qiáng)烈的致纖維化因子，其在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)通過激活R-Smads通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT[2]。Tβ4的降解產(chǎn)物Ac-SDKP已經(jīng)證明能通過抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2磷酸化發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用，有研究指出Tβ4在硬化腎小球中表達(dá)升高[3].因此，為探究在腎臟纖維化中Ac-SDKP與Tβ4的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)TGF-β1刺激誘導(dǎo)體外大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后Tβ4的表達(dá)及予不同濃度的Ac-SDKP共同作用后Tβ4表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討Tβ4在腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后的表達(dá)及Tβ4和Ac-SDKP的相互作用對(duì)EMT的影響，為阻斷和逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化探尋新的、合理有效的方法尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為腎臟纖維化的藥物治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 兔多克隆Tβ4抗體(abcam公司)；兔多克隆a-SMA抗體(北京博奧森生物有限公司)；重組人TGF-β1蛋白(廣州佰浩生物技術(shù)有限公司)；Ac-SDKP(Abbiotec公司)；卡托普利(廣州齊云生物科技有限公司)；兔EnVision二步法檢測(cè)試劑盒(DAKO公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的傳代及藥物刺激 往培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶溶液1ml，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使所有細(xì)胞表面覆蓋有消化液，1～2 min后，在顯微鏡下見細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，吸走消化液終止消化。加入培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞使細(xì)胞分開，脫落成為單細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/mL的密度種植于6孔板里，隨機(jī)分為6組：①空白對(duì)照組，②TGF-β1(5 ng/mL)刺激組，③TGF-β1(5 ng/mL)+卡托普利(1 μmol/L)，④TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(0.1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)組，⑤TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)組，⑥TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(10 nmol/L)+卡托普利(1μmol/L)，每組做三個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。加卡托普利為防止Ac-SDKP的降解。

1.2.2培養(yǎng)細(xì)胞的Envision免疫組化二步法實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 細(xì)胞爬片 培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長(zhǎng)到2×105個(gè)細(xì)胞/ ml 時(shí)，用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液；在滅菌的六孔板中每孔鋪上一塊蓋玻片；取細(xì)胞懸液分別滴到玻片上，讓細(xì)胞貼片30 min左右；然后在培養(yǎng)皿中補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，放于37 ℃、5%CO2μmol/L培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%后換不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于G0期。

1.2.2.2 細(xì)胞免疫組化染色 取出細(xì)胞，PBS沖洗 5 min×3次→4%的多聚甲醛固定20 min；PBS沖洗 5 min×3次→0.3%的TritoonX-100通透20 min；PBS沖洗 5 min×3次→3%的過氧化氫孵育15 min；PBS沖洗 5 min×3次→分別加入一抗兔抗人Tβ4(1∶800)和兔抗人α-SMA(1∶100)，置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜(14～16 h)；PBS沖洗5 min×3次→加DAKO ChemMate EnVision/HRP，Rabbit/Mouse (ENV) 二抗，置于 37 ℃溫箱孵育30 min；取出細(xì)胞，PBS沖洗5 min×3次；加入DAKO公司的DAB顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用，顯微鏡下觀察，3 min后用自來水終止顯色反應(yīng)，自來水洗5min；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，自來水洗1 min；鹽酸酒精分化5 s后用水洗2 min；溫水2 min返藍(lán)，風(fēng)筒吹干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3Tβ4和α-SMA細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果的半定量分析 采用Image Pro-plus6.0病理圖像分析系統(tǒng),通過光學(xué)顯微鏡放大200倍攝取圖像,輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi),對(duì)圖像進(jìn)行灰度變換,使陽(yáng)性面積與背景分開,進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量。需要測(cè)量每張照片選擇區(qū)域的面積(area)與累積光密度(IOD),方法步驟如下：① 攝片,每張切片在200倍鏡下選擇6個(gè)不重復(fù)的視野。② 軟件算出每張照片的IOD和area,之后對(duì)染成藍(lán)色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)，作為細(xì)胞數(shù)N，以O(shè)D=IOD/(N×area)作為免疫組化染色半定量指標(biāo)。③ 計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各照片OD值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤。④ 用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各實(shí)驗(yàn)組的OD值之間是否有顯著性差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用IPP6.0圖像分析軟件計(jì)算出各組的OD值，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；組間均數(shù)比較前，經(jīng)Levene檢驗(yàn)總體方差，如方差齊選用方差分析，方差不齊選用近似t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)有相關(guān)趨勢(shì)的變量，采用Pearson相關(guān)分析，P<0.01為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)由SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)改變

正常的大鼠腎小管上皮細(xì)胞成圓形或類圓形，呈鵝卵石樣排列；TGF-β 1(5 ng/mL)刺激48h后細(xì)胞形態(tài)明顯拉長(zhǎng)，呈梭長(zhǎng)形，似成纖維細(xì)胞；予Ac-SDKP干預(yù)后，濃度為0.1和1 nmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，10 nmol/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)似有恢復(fù)類圓形，但未達(dá)到正常的細(xì)胞形態(tài)。(見圖1)

ABCDEF

A.空白對(duì)照組 B TGF-β1C TGF-β1+卡托普利 D TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L) E TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L) F TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖1 TGF-β 1(5 ng/mL)刺激腎小管上皮細(xì)胞48 h后細(xì)胞形態(tài)變化(光鏡×400)

2.2 細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果

2.2.1腎小管上皮細(xì)胞中Tβ4的表達(dá)變化 空白對(duì)照組細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)Tβ4呈弱陽(yáng)性表達(dá)，OD值為(0.203±0.009)；TGFβ-1陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，腎小管上皮細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)Tβ4的表達(dá)(褐色)明顯增加，OD值為(0.346±0.016)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGFβ-1+卡托普利組褐色稍有減少，但變化不明顯，OD值為(0.337±0.021)，與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用組與TGFβ-1陽(yáng)性對(duì)照組比較，Tβ4表達(dá)均降低，10 nmol/L降低最顯著，OD值分別為(0.321±0.013)、(0.297±0.018)、(0.237±0.008)，與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L分別與10 nmol/L組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見圖2、3)

2.2.2腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA 的表達(dá)變化 空白對(duì)照組胞漿內(nèi)α-SMA僅有微量表達(dá)，OD值為(0.184±0.007)；TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)α-SMA的表達(dá)(褐色)明顯增加，OD值為(0.345±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；加入卡托普利后α-SMA的表達(dá)稍降低，但與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組相比下降不明顯，OD值為(0.334±0.023) ，與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用組與TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組比較，α-SMA表達(dá)均降低，10 nmol/L降低最顯著，OD值分別為(0.312±0.015)、(0.304±0.016 )、(0.225±0.018)，與TGFβ1陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L組分別與10 nmol/L組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。(見圖4、5)

ABCDEF

A.空白對(duì)照組；B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L); F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖2 免疫組化染色顯示TGF-β 1單獨(dú)作用及與不同濃度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠腎小管上皮細(xì)胞Tβ4的表達(dá)(×400)

A.空白對(duì)照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖3 各組細(xì)胞Tβ4免疫組化染色的半定量分析

ABCDEF

A.空白對(duì)照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖4 免疫組化染色顯示TGF-β 1單獨(dú)作用及與不同濃度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)(×400)

A.空白對(duì)照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖5 各組細(xì)胞a-SMA免疫組化染色的半定量分析

2.2.3Tβ4和α-SMA在TGFβ-1刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT后表達(dá)量的相關(guān)性分析 Tβ4和α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)存在直線正相關(guān)關(guān)系且差異具有計(jì)學(xué)意義(r=0.995，P<0.01)。(見圖6)

0.3500.3000.2500.2000.150α-SMA陽(yáng)性信號(hào)的平均OD值0.2100.2400.2700.3000.330Tβ4陽(yáng)性信號(hào)的平均OD值RSqLinear=0.99

圖6 Tβ4和 α-SMA在TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT后表達(dá)量的相關(guān)分析

3 討論

纖維化是慢性腎臟疾病進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵因素，EMT在成熟組織纖維化期間成纖維細(xì)胞的發(fā)生過程中起重要作用，來自于腎臟纖維化的研究證據(jù)表明，有超過三分之一的成纖維細(xì)胞起源于腎小管上皮細(xì)胞[2]。細(xì)胞極性消失和細(xì)胞間緊密連接消失、上皮細(xì)胞的表型標(biāo)志物E-鈣粘素的表達(dá)下調(diào)，并表達(dá)波形纖維蛋白、α-SMA、成纖維細(xì)胞特異蛋白1(Fibroblast-specific proteinl,FSP1)，是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志。

Hong KO等[4]通過體外培養(yǎng)的口腔鱗癌細(xì)胞證明過表達(dá)Tβ4可使E-鈣粘素表達(dá)下調(diào)和波形纖維蛋白表達(dá)上調(diào)，據(jù)此推測(cè)Tβ4是口腔鱗癌中EMT樣表型的重要調(diào)節(jié)者。Tβ4是由44個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)高度保守的水溶性酸性多肽，是β胸腺肽家族中含量最高的成員，被認(rèn)為是人的血小板內(nèi)主要的球形肌動(dòng)蛋白(G-肌動(dòng)蛋白)結(jié)合肽[5]。Tβ4經(jīng)過兩步水解反應(yīng)最終釋放Ac-SDKP，而Ac-SDKP幾乎唯一的被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶水解[6]。在一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中證明，Ac-SDKP能夠阻止高血壓和慢性腎臟病中膠原蛋白的合成[7]及逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心臟的炎癥和纖維化[8]。在一些體外研究中，Ac-SDKP已經(jīng)被證明能夠抑制腎臟成纖維細(xì)胞的增生、阻止腎髓質(zhì)纖維化[9]和抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白的產(chǎn)生[10]。但是Ac-SDKP對(duì)體外腎小管上皮細(xì)胞的作用的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中予TGF-β1刺激后，大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，細(xì)胞由類圓形變成梭形，同時(shí)α-SMA的表達(dá)也上調(diào)，提示腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。在正常的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Tβ4呈弱陽(yáng)性表達(dá)，α-SMA僅有微量的表達(dá)，TGF-β1刺激后，Tβ4和α-SMA的表達(dá)均顯著增加，證實(shí)在TGF-β1(5 ng/mL)時(shí)可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT；加入卡托普利與TGF-β1共同作用后，Tβ4和α-SMA的表達(dá)與TGF-β1刺激后誘導(dǎo)Tβ4和α-SMA的表達(dá)量相比變化不大，提示雖然卡托普利部分是通過抑制Ac-SDKP的降解而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用，但內(nèi)源性Ac-SDKP的濃度不足以達(dá)到抗纖維化的效應(yīng)，通過加入外源性Ac-SDKP，Tβ4和α-SMA的表達(dá)下降，濃度為10 nmol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)，與TGF-β1刺激組相比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Hongmei Peng等[11]所報(bào)道的相符。Tβ4隨Ac-SDKP濃度的增加而下調(diào)，10 nmol/L時(shí)Tβ4降低最顯著，推測(cè)Ac-SDKP通過影響Tβ4的表達(dá)，進(jìn)而影響Tβ4介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT，Ac-SDKP通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)Tβ4的表達(dá)尚不能確定。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Tβ4和α-SMA之間存在直線正相關(guān)關(guān)系，提示Ac-SDKP的發(fā)現(xiàn)可以為抗纖維化藥物的研究提供新的方向，可通過抑制Tβ4的表達(dá)，從而抑制EMT，也許是治療腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)新途徑。