關(guān)信民，張小梅，王淑香，李彪，何蕓，魏遠(yuǎn)玲，曾芳，趙強(qiáng)*

(1.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院,暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市紅十字會(huì)醫(yī)院急診科,廣東 廣州 510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院心內(nèi)科,廣東 佛山 528315；3.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院ICU,廣東 廣州 510800；4.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院,暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市紅十字會(huì)醫(yī)院心內(nèi)科,廣東 廣州 510220)

左心室重構(gòu)是慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。β3腎上腺素能受體(β3受體,β3-adrenergic receptor,β3-AR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)超家族，由一個(gè)細(xì)胞外糖基化的氨基末端(N)、一個(gè)細(xì)胞外的羥基末端(C)和三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)、細(xì)胞外環(huán)連接的七個(gè)疏水跨膜區(qū)組成[1]。研究證實(shí)，與抑制型G蛋白(inhibitory G protein,Gi)偶聯(lián)的β3-AR參與了CHF的心室重構(gòu)和心室功能下降[2,3]。分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中一組主要的信號(hào)分子，作為MAPK家族重要的成員酶，p38 MAPK在心肌肥厚、心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。研究提示β-AR可能與MAPK偶聯(lián)參與心室肥厚[7,8]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)建立CHF大鼠模型及在此基礎(chǔ)上心室β3-AR進(jìn)一步上調(diào)的大鼠模型，初步探討CHF大鼠左心室β3-AR上調(diào)是否對(duì)p38 MAPK表達(dá)水平產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡的雄性Wistar大鼠18只，體質(zhì)量為230～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間籠養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

BRL-37344(美國(guó)Sigma公司)；注射用青霉素鈉(中國(guó)哈藥集團(tuán)制藥總廠)。

1.3 主要試劑

兔抗大鼠磷酸化-p38 MAPK多克隆抗體(p-p38 MAPK)(英國(guó)Abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國(guó)Bioworlde公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(中國(guó)LG公司)；蘇木素染液(中國(guó)上海化學(xué)試劑有限公司)；Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司)；喹啉酸(BCA)法蛋白含量測(cè)定試劑盒(中國(guó)南京凱基生物發(fā)展有限公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(中國(guó)上海BestBio貝博生物)；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(中國(guó)上海BestBio貝博生物)；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)研究所)；生物素標(biāo)記的分子量Marker(10～100 KD)(美國(guó)FERMETAS公司)；β-微管蛋白(Tublin)、5%牛血清白蛋白、ECL顯影劑均購(gòu)自美國(guó)Bioworlde公司。

1.4 主要儀器

BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(中國(guó)四川成都泰盟科技有限公司)；倒置光學(xué)顯微鏡攝影系統(tǒng)(日本Olympus公司)；病理圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；核酸蛋白分析儀(美國(guó)Beckman公司)電泳儀、微型電轉(zhuǎn)移裝置、電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.5 方法

1.5.1動(dòng)物模型制作及分組 Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=6)和模型組(n=12)。采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立CHF大鼠模型[2]。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/1 kg)麻醉后，鈍性分離腹主動(dòng)脈，于左腎動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈分叉上方2 mm處將腹主動(dòng)脈與9號(hào)鈍頭探針(外徑為0.8 mm)一起結(jié)扎，小心抽出針頭，結(jié)扎線留置，以持續(xù)縮窄腹主動(dòng)脈。假手術(shù)組進(jìn)行假手術(shù)處理，但不予腹主動(dòng)脈縮窄。大鼠縫合腹腔時(shí)均經(jīng)腹腔注射青霉素鈉以預(yù)防感染。飼養(yǎng)12周后，假手術(shù)組大鼠全部存活，模型組大鼠死亡1只。11只大鼠再分為CHF組(n=5)和BRL組(n=6)。BRL組大鼠經(jīng)尾靜脈注射BRL-37344(0.4 nmol/kg/min)，每次持續(xù)10 min，每周2次，共4周；假手術(shù)組、CHF組大鼠經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。4周后三組大鼠均全部存活。

1.5.2血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管(傳感器)入左心室，應(yīng)用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。待大鼠穩(wěn)定10 min后，測(cè)定左心室收縮末壓(left ventricular end systolic pressure,LVESP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(the maximal rate of rise of left ventricular pressure,+dp/dtmax)及左心室內(nèi)壓最大下降速率(the maximal rate of fall of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。所有指標(biāo)均取10個(gè)心搏的平均值。

1.5.3心臟稱重、HE染色及免疫組化 過(guò)量烏拉坦處死大鼠后，測(cè)體質(zhì)量。開(kāi)胸取出心臟，小心分離出左心室。用電子天平(精確到0.01 mg)稱取左心室(包括室間隔)濕質(zhì)量(left ventricular absolute mass,LVAM,mg)，與體質(zhì)量(g)相除，得到左心室質(zhì)量指數(shù)(the index of left ventricular mass,LVMI)。左心室組織4%多聚甲醛固定24 h。取出標(biāo)本，流水沖洗15 min，切取合適大小組織塊(厚度約0.2 cm)。乙醇、二甲苯脫水和透明后，石蠟包埋并切片。標(biāo)本進(jìn)行HE染色和鏡檢。標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，分別滴加p-p38 MAPK一抗和二抗孵育，經(jīng)DAB顯色和復(fù)染后，脫水、透明、封固、鏡檢。

1.5.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 采用二步法RT-PCR測(cè)定大鼠左心室β3-AR mRNA表達(dá)。按照Trizol試劑盒提取大鼠左心室總RNA，核酸蛋白分析儀計(jì)算總RNA濃度。取總RNA 2 μL經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA。β3-AR(444 bp)引物設(shè)計(jì)參照既往試驗(yàn)方法[3]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：上游5’-AGT GGG ACT CCT CGT AAT G-3’，下游5’-CGC TTA GCT ACG ACG AAC-3’。以β-actin(187 bp)作為內(nèi)參照，引物序列為：上游5’-GAC AAC GGC TCC GGC ATG TG-3’，下游5’-TGA GGA TGC CTC TCT TGC-3’。cDNA擴(kuò)增經(jīng)94 ℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s)，72 ℃ 10min。取7 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)分析、計(jì)算mRNA表達(dá)的強(qiáng)度。

1.5.5蛋白免疫印跡法 剪取左心室冷凍組織0.1 g，PBS緩沖液沖洗。加入2 mL細(xì)胞裂解液，剪碎組織并加入液氮充分研磨，提取組織液至離心管。將含有組織液的離心管置冰上裂解30 min，裂解液移至離心管中，然后在4 ℃下12 000 r/min離心8 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20 ℃冰箱中保存。采用BAC法測(cè)定樣本蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的分子量選取配制12%的分離膠及5%的濃縮膠，樣本每孔上樣20 μL、Marker 5 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。卸膠、剪取硝酸纖維素膜。將凝膠、硝酸纖維素膜、轉(zhuǎn)膜濾紙放入轉(zhuǎn)膜臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取膜后，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。TBST緩沖液洗膜10 min，3次；加入一抗(1∶1 000)、內(nèi)參(15 000)，4 ℃搖床中孵育過(guò)夜。次日TBST緩沖液洗膜10 min，3次；加入二抗(1∶5 000)，室溫下?lián)u床中孵育1 h。將ECL顯影劑滴加于硝酸纖維素膜上孵育5 min。暗室下，采用Quality圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析。以β-Tublin(分子量: 55 kD)作為內(nèi)參照，計(jì)算p-p38MAPK(分子量: 41 kD)與β-Tulblin積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及LVMI的比較

與假手術(shù)組比較，CHF組和BRL組大鼠的LVESP、±dp/dtmax的絕對(duì)值均顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著升高(P<0.01)。與CHF組比較，BRL組LVESP、±dp/dtmax絕對(duì)值降低(P<0.01)，LVEDP升高(P<0.05) ，見(jiàn)表1。

3組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。與假手術(shù)組(1.680±0.078)比較，CHF組(2.596±0.017)及BRL組(2.733±0.045)大鼠LVMI均顯著增加(均P=0.000)；BRL組大鼠LVMI顯著高于CHF組(P=0.003)。

表1 三組大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

注：LVESP：左心室收縮末壓，LVEDP：左心室舒張末壓，+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大上升速率，-dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大下降速率。與假手術(shù)組比較，aP<0.001；與CHF組比較，bP<0.01，cP<0.05。

2.23組大鼠HE染色及免疫組化結(jié)果

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠左心室肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)細(xì)胞水腫及壞死；CHF組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)明顯水腫，細(xì)胞排列紊亂，肌纖維斷裂；BRL組大鼠心肌細(xì)胞水腫進(jìn)一步加重，細(xì)胞明顯肥大，肌纖維斷裂(圖1)。免疫組織化學(xué)染色顯示，3組大鼠左心室肌組織中均有p-p38 MAPK表達(dá)，其表達(dá)部位在細(xì)胞核中(圖2)。

假手術(shù)組CHF組BRL組

圖1 3組大鼠左心室肌組織HE染色結(jié)果(×20)

假手術(shù)組CHF組BRL組

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)3組大鼠左心室肌組織p-p38MAPK表達(dá)(上圖×10,下圖×20)

2.3 3組大鼠左心室β3-AR mRNA 表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，3組大鼠左心室組織中均有β3-AR表達(dá)(圖3)。與假手術(shù)組(0.611±0.169)比較，CHF組(1.442±0.143)和BRL組(1.906±0.079)大鼠左心室β3-AR mRNA表達(dá)水平均上調(diào)(均P=0.000)；其中BRL組大鼠β3-AR表達(dá)水平較CHF組顯著升高 (P=0.001)。

400250100M123

M：marker；1：假手術(shù)組，2：CHF組，3：BRL組；上條：β3-AR，下條：β-actin

圖3 大鼠左心室肌組織β3-AR mRNA表達(dá)

2.4 3組大鼠蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，3組大鼠左心室組織中均有p-p38MAPK表達(dá)(圖4)。與假手術(shù)組(0.328±0.023)比較，CHF組(0.634±0.054)和BRL組(0.689±0.031)大鼠左心室p-p38MAPK表達(dá)水平均升高(均P=0.000)，其中BRL組大鼠p-p38MAPK表達(dá)水平較CHF組有升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。

p-p38MAPKβ-Tublin假手術(shù)組CHF組BRL組

圖4 3組大鼠左心室肌組織p-p38 MAPK蛋白表達(dá)

3 討論

β3-AR作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員，在心室內(nèi)偶聯(lián)于Gi-NO-cGMP信號(hào)通路。在CHF早期 β3-AR 代償性上調(diào)可能是為阻止 β1-AR、 β2-AR 的過(guò)度刺激，避免心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷的一種補(bǔ)救途徑。但CHF進(jìn)展至晚期，β3-AR持續(xù)增多，加之 β3-AR不會(huì)因長(zhǎng)期激動(dòng)劑刺激而脫敏[9]，這種代償機(jī)制將失衡，持續(xù)的負(fù)性肌力作用導(dǎo)致心功能的進(jìn)展性惡化，在循環(huán)兒茶酚胺增加時(shí)這種作用更明顯，目前認(rèn)為 β3-AR 也是治療的靶點(diǎn)[10,11]。

β3-AR的負(fù)性肌力作用參與了心室重構(gòu)和心功能惡化，主要機(jī)制為β3-AR激動(dòng)抑制L型Ca2+通道電流(L-type calcium current,Ica,L)或鈣瞬變[12,13]。非選擇性β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素使豚鼠心室肌細(xì)胞Ica,L密度增加210%；但在BRL-37344(10-7mol/L)存在的情況下，Ica,L密度僅有對(duì)照組的58%[12]。Zhao等[2]的研究采用主動(dòng)脈縮窄法建立CHF大鼠模型，與假手術(shù)組比較，CHF大鼠LVMI及右心室質(zhì)量指數(shù)均顯著增加(P<0.01)；左心室、右心室β3-AR mRNA表達(dá)有2～3倍上調(diào)(P<0.01)，且β3-AR表達(dá)與心室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)。CHF大鼠尾靜脈注射BRL-37344進(jìn)一步加重了心臟重構(gòu)：左心房?jī)?nèi)徑，左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、收縮末內(nèi)徑(LVESD)，舒張期室間隔及左心室后壁厚度，左心室質(zhì)量均顯著增加(P<0.05或0.01)；左心房射血分?jǐn)?shù)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短率(fraction shortening,FS)均顯著降低(P<0.05或0.01)[14]。Kayki-Mutlu等[15]的研究以糖尿病大鼠為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRL-37344呈劑量依賴性的降低LVDP、±dp/dtmax；此效應(yīng)可以被SR 59230阻斷；同時(shí)，心肌Giα2 mRNA表達(dá)上調(diào)。Montaudon等[16]選取Lewis大鼠為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇性β3-AR激動(dòng)劑SR 58611A顯著減少左心室肌細(xì)胞縮短率(39.71±4.9%,P<0.05)，此效應(yīng)可以被Gi蛋白抑制劑百日咳毒素阻斷。β3-AR激動(dòng)顯著增加LVEDD (P<0.05)。β3-AR表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，±dp/dtmax、左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure,LVDP)均顯著下降(P<0.05)。Zhang等[3]的研究選擇2型糖尿病大鼠，結(jié)扎左前降支建立心肌梗死模型。與假手術(shù)組比較，心肌梗死大鼠LVEDD、LVMI顯著增加(P<0.05)，LVEF及左心室后壁收縮期增厚率顯著降低(P<0.01)；免疫組化顯示心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)顯著增加(P<0.05)。同時(shí)，心肌β3-AR和Gi蛋白表達(dá)水平顯著增加。景佳妮等[17]結(jié)扎SD大鼠左前降支建立心肌梗死模型，術(shù)后4周發(fā)生心力衰竭(心衰)的大鼠，隨機(jī)接受腹腔注射選擇性β3-AR阻滯劑SR 59230A或生理鹽水。結(jié)果顯示SR 59230A使心衰大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂和心肌纖維斷裂減輕，炎性細(xì)胞減少。本研究中，BRL-37344進(jìn)一步上調(diào)大鼠衰竭心室肌β3-AR mRNA表達(dá)，伴隨著大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)一步惡化。同時(shí)，BRL-37344使CHF大鼠衰竭左心室肌的病理學(xué)改變進(jìn)一步加重。因此，β3-AR激動(dòng)進(jìn)一步加重了CHF大鼠心室重構(gòu)和功能下降。

p38 MAPK激活在心臟重構(gòu)中起著重要作用。雙特異性磷酸酶14(Dusp14)是MAPK通路重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。Li等[18]的研究選擇Dusp14基因敲除大鼠和心臟特異性表達(dá)Dusp14的轉(zhuǎn)基因大鼠，以野生型大鼠為對(duì)照，主動(dòng)脈縮窄法建立心肌肥厚模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dusp14基因敲除大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)，左心室膠原含量及間質(zhì)CVF顯著增加；LVEDD、LVESD顯著增加，LVEF及FS顯著降低；心肌纖維化標(biāo)志物如I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)水平顯著上調(diào)。而在心臟特異性表達(dá)Dusp14的轉(zhuǎn)基因大鼠中，主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心臟重構(gòu)、纖維化及收縮功能下降會(huì)減輕。同時(shí)，與野生型大鼠比較，Dusp14基因敲除大鼠心肌p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；而在心臟特異性表達(dá)Dusp14的轉(zhuǎn)基因大鼠，主動(dòng)脈縮窄上調(diào)心肌p-p38 MAPK表達(dá)的作用會(huì)減弱。β-AR信號(hào)通路刺激可激活一系列壓力激活的蛋白激酶，其中就包括p38 MAPK，β-AR激動(dòng)可通過(guò)介導(dǎo)p38 MAPK 參與心室重構(gòu)[19,20]。Peter等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，心臟過(guò)表達(dá)β1-AR或β2-AR的小鼠，均出現(xiàn)心率明顯增快，LVEDD、LVESD顯著增加，LVEF及FS顯著降低；LVMI、心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化顯著增加。在p38α MAPK顯性負(fù)性突變體轉(zhuǎn)基因小鼠中，心臟過(guò)表達(dá)β2-AR對(duì)心臟重構(gòu)、收縮功能、心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化的效應(yīng)會(huì)被減弱。另一項(xiàng)研究顯示，下調(diào)p38 MAPK表達(dá)，可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的CHF大鼠心室重構(gòu)，改善收縮和舒張功能[21]。

本研究結(jié)果顯示，CHF組和BRL組大鼠左心室p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(均P<0.01)；BRL組大鼠p-p38 MAPK表達(dá)水平較CHF組有升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.689±0.031 vs 0.634±0.054,P=0.065)。分析原因可能為：①β3-AR激動(dòng)可能不偶聯(lián)于p38MAPK信號(hào)通路。②選擇的研究對(duì)象不同，CHF大鼠尾靜脈注射BRL-37344上調(diào)心室β3-AR表達(dá)、表達(dá)人β3-AR的倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株[22]，或原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞[23]等；不同的β3-AR特異性激動(dòng)劑激活p38 MAPK可能具有不同的效能[22]；β3-AR可能尚與激動(dòng)型G蛋白(stimulatory G protein,Gs)-環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路偶聯(lián)[24]等原因。

綜上所述， BRL-37344進(jìn)一步加重CHF大鼠左心室重構(gòu)和功能下降，上調(diào)了β3-AR的表達(dá)，但β3-AR激動(dòng)可能對(duì)p38 MAPK表達(dá)無(wú)明顯影響。下一步可通過(guò)選擇不同β3-AR激動(dòng)劑、分離大鼠心室肌細(xì)胞等方法繼續(xù)研究，以明確CHF時(shí)β3-AR激動(dòng)是否與MAPK信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。