任嬌艷 李宇娟 史傳超 張 婷 李溢佳 袁爾東* 梁 明*

（1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640

2 無限極（中國）有限公司 廣州 510665）

土茯苓，是百合科光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根莖，其黃酮類成分具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗疲勞效果。研究表明，土茯苓提取物對XOD具有明顯的抑制作用，可降低尿酸的生成，是臨床上用于替代別嘌呤醇治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的潛在藥物[1]。土茯苓抑制XOD活性的物質(zhì)基礎(chǔ)是表兒茶素、落新婦苷、槲皮素及柚皮素等。目前國內(nèi)外對天然產(chǎn)物抗痛風(fēng)藥的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類可通過促進尿酸排泄，抑制XOD活性等多途徑多靶點防治高尿酸血癥[2]。

鰹魚，屬鱸形總目，鰹屬，是一種海洋洄游魚類，研究發(fā)現(xiàn)鰹魚的胃蛋白水解物抗氧化活性高[3]。從鰹魚中鑒定合成的多肽DLDLRKDLYAN具很強的ABTS自由基和單線態(tài)氧清除能力[4]。日本著名海洋生物科技公司YSK從鰹魚肌肉中提取鵝肌肽和肌肽兩種天然深海魚低聚肽，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的降尿酸功效。鰹魚小分子低聚肽與蛋白相比更容易被人體吸收利用[5]。報道發(fā)現(xiàn)，小分子肽與天然產(chǎn)物交互作用后，可提高其生物活性，如血清白蛋白可與某些藥物分子通過相互作用將藥物分子更有效地運輸?shù)桨衅鞴賉6-8]。因此，研究小分子多肽與中草藥活性成分的交互作用具有重要的科學(xué)和實際應(yīng)用意義。

本試驗以土茯苓和鰹魚為原料，制備土茯苓黃酮和鰹魚蛋白肽，比較水提土茯苓和醇提土茯苓中活性成分的含量、DPPH·清除活性及XOD抑制活性，并以蛋白質(zhì)回收率、DPPH·清除活性和XOD抑制活性為指標(biāo)篩選鰹魚酶解的水解酶。在此基礎(chǔ)上，探討土茯苓黃酮與鰹魚蛋白肽交互作用產(chǎn)物的XOD抑制活性、DPPH·清除活性及其穩(wěn)定性。最后，利用熒光光譜法研究土茯苓黃酮與鰹魚蛋白肽交互作用的猝滅機理。研究對中草藥活性成分與小分子活性肽的相互作用機理及降尿酸復(fù)合產(chǎn)品的研發(fā)，具有理論和實踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土茯苓，廣州南北行中藥飲片有限公司；鰹魚，山東。

2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、辣根過氧化物酶，美國Sigma公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

UV754N紫外-可見光分光光度計，INESA上海儀電分析儀器有限公司；HYP-1020消化爐，上海書培實驗設(shè)備有限公司；KDN-1型自動凱氏定氮儀，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；日立熒光光譜儀，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司廣州分公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 土茯苓提取物的提取 將土茯苓干燥根莖用高速粉碎機粉碎，過60目篩后備用。采用兩種溶劑制備土茯苓提取液。

（1）土茯苓水提：稱取一定量土茯苓粉末，按料液比1∶20加入蒸餾水，浸泡6 h，80℃下超聲30 min，4℃，8 000 r/min離心 20 min，提取 3次，合并濾液后蒸發(fā)濃縮至一定體積，冷凍干燥，保存。

（2）土茯苓醇提：稱取一定量土茯苓粉末，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，浸泡6 h，80℃下超聲提取 30 min，4℃，8 000 r/min離心 20 min，提取3次，合并濾液后蒸發(fā)濃縮至一定體積，冷凍干燥，保存。

1.3.2 土茯苓提取物活性成分測定 參照文獻[9-10]亞硝酸鈉-氯化鋁比色法和苯酚-硫酸法，稍作修改。分別測定提取物中總黃酮和總多糖含量。將提取物溶液與3倍體積的無水乙醇混合均勻，于4℃冰箱過夜醇沉，再經(jīng)4℃，8 000 r/min離心20 min，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，冷凍干燥得到土茯苓黃酮。

1.3.3 鰹魚蛋白肽水解酶篩選 將完整的鰹魚攪碎成魚糜，稱取一定質(zhì)量的鰹魚魚糜，按照料液比1∶3加入蒸餾水，沸水浴5 min預(yù)處理滅酶，按加酶量（E/S）1%分別加入4種水解酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶），酶解溫度為55℃，酶解pH 7.0，酶解4 h后，沸水浴10 min滅酶，在4℃，8 000 r/min離心20 min后過濾，蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到鰹魚蛋白肽。

1.3.4 蛋白質(zhì)回收率的測定 采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003）測定總氮含量，按照公式（1）計算其蛋白質(zhì)回收率（Nitrogen recovery，NR）。

1.3.5 XOD抑制活性測定 抑制XOD活性是降低尿酸生成的有效途徑，常用于評價藥物的體外降尿酸活性[11-13]。黃嘌呤氧化酶（XOD）將黃嘌呤催化氧化成尿酸和H2O2，H2O2再經(jīng)過辣根氧化物酶（HRP）作用分解，可使4-氨基安替比林與苯酚形成亞醌類紅色化合物，其反應(yīng)原理式（2）、（3）。

參照雙酶偶聯(lián)法[14]，并稍作修改。分別取100 μL pH 8.0 Tris-HCl緩沖液和待測樣品于10 mL離心管，加入 50 μL 0.52 U/mL的XOD，37℃保溫10 min，加入 2.9 mL顯色液和400 μL 2 mmol/L黃嘌呤溶液，37℃保溫20 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL 1 mol/L NaOH溶液滅酶，同時做3個平行試驗，508 nm波長處測定相應(yīng)的吸光值（As）。以不加XOD反應(yīng)體系作為參比，Tris-HCl緩沖液為空白對照（A0）。 按照公式（4）計算XOD抑制率。

1.3.6 DPPH·清除活性測定 參照文獻 [15-16]，用DPPH·清除率的IC50值來表征提取物的抗氧化活性。取2 mL樣品與2 mL DPPH·溶液混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長下測相應(yīng)的吸光值，記為A樣。以2 mL蒸餾水與2 mL DPPH·溶液做空白對照，記為A0，2 mL蒸餾水與95%乙醇混合溶液做參比。按照公式（5）計算DPPH·清除率。

1.3.7 交互作用體系建立及活性評價 根據(jù)土茯苓黃酮和鰹魚蛋白肽的XOD抑制活性，將17 μg/mL土茯苓黃酮和11 mg/mL鰹魚蛋白肽進行復(fù)配，比較交互作用后與兩者分別測得XOD抑制活性之間的差異。

同時依據(jù)土茯苓黃酮和鰹魚蛋白肽的DPPH·清除活性，將2 mg/mL鰹魚蛋白肽與不同質(zhì)量濃度土茯苓黃酮（5，7，9，11 μg/mL）進行復(fù)配，并測定相應(yīng)的DPPH·清除活性。篩選DPPH·清除活性最好的復(fù)合物，進一步研究其抗氧化活性的穩(wěn)定性：

（1）溫度的影響：根據(jù)工藝生產(chǎn)殺菌技術(shù)，研究了3個溫度條件（常溫：25℃，1 h；巴士殺菌：62～65℃，30 min；高溫長時滅菌：121℃，20 min）下DPPH·清除活性的變化。

（2）pH值的影響：根據(jù)多肽和中草藥液體產(chǎn)品的酸度值，研究了 3 個 pH 值（5.5，6.0，6.5）條件下產(chǎn)物的DPPH·清除活性。

1.3.8 熒光光譜分析法 參照文獻[17-19]方法檢測樣品的熒光吸收光譜，并稍作修改。用pH 7.40 Tris-HCl緩沖溶液將樣品配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，在25℃反應(yīng)1 h后，在280 nm波長處激發(fā)，測定溶液在295～500 nm波長處的熒光吸收光譜。

（1）質(zhì)量濃度對鰹魚蛋白肽熒光吸收光譜的影響：用Tris-HCl緩沖溶液將鰹魚蛋白肽配制成蛋白質(zhì)量濃度分別為10，15，20，25，30 μg/mL的溶液，并測定相應(yīng)的熒光吸收強度。

（2）土茯苓黃酮對鰹魚蛋白肽熒光吸收光譜的影響：用Tris-HCl緩沖溶液將土茯苓黃酮配制成質(zhì)量濃度為10，20，40，80，160 μg/mL的溶液，分別與25 μg/mL鰹魚蛋白肽復(fù)配，測定相應(yīng)的熒光吸收強度。

（3）溫度對交互作用產(chǎn)物熒光吸收強度的影響將復(fù)合物置于不同溫度（25，37℃）下反應(yīng)1 h后，測定其熒光吸收強度。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件分析，以P<0.05為顯著性評定指標(biāo)，數(shù)據(jù)用±SD表示，試驗數(shù)據(jù)采用Graph prism和Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土茯苓黃酮提取物的篩選及活性評價

由圖1a可知，提取物的多糖提取率間無顯著性差異，而醇提物的黃酮提取率顯著高于水提物（P<0.01）。由圖1b和1c可知，醇提物的DPPH·清除率IC50值顯著低于水提物，且隨質(zhì)量濃度增加其XOD抑制活性升高，而水提物幾乎無XOD抑制活性。其原因可能是水提與醇提所得黃酮類物質(zhì)種類組成不同，且醇提物中含有部分醇溶性黃酮，表現(xiàn)出更好的DPPH·清除活性和XOD抑制活性。因此，用醇提土茯苓黃酮做進一步交互作用研究。

圖1 不同提取物的多糖和黃酮提取率（a）、DPPH·清除率IC50值（b）和XOD抑制活性（c）Fig.1 The extract rate of polysaccharide and flavonoids from different extracts（a），DPPH· scanvenging rate IC50values（b）and XOD inhibition activities（c）

2.2 鰹魚蛋白肽的篩選及活性評價

由圖2a可知，木瓜蛋白酶酶解液的蛋白回收率顯著高于其它水解酶酶解液（P<0.05），且其XOD抑制活性最高為33.54%。由圖2b可知，木瓜蛋白酶的DPPH·清除率IC50值最小，活性顯著高于其它各水解酶（P<0.01）。木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，其酶切位點為精氨酸和賴氨酸的羧基端，N-端具有2個羧基的氨基酸和芳香L-氨基酸的肽鍵。

由圖2c木瓜蛋白酶酶解液的氨基酸含量分布可知，其中具有2個羧基的天冬氨酸、谷氨酸的百分含量最高，精氨酸和賴氨酸的含量也相對較高，且木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)回收率最高，說明其酶解液中多肽的種類和數(shù)量較其它酶解液多。同時，酶解液中含有9.33%的脯氨酸，不僅疏水性強，可形成疏水相互作用，其吡咯烷結(jié)構(gòu)可通過氫鍵與酚羥基結(jié)合[19]，因此木瓜蛋白酶酶解所得鰹魚蛋白肽活性最高。

圖2 不同水解酶酶解液的蛋白回收率與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為30 mg/mL時XOD抑制活性（a）、DPPH·清除率IC50值（b）和木瓜蛋白酶酶解液總氨基酸圖譜（c）Fig.2 Protein recovery rates and XOD inhibition activities at 30 mg/mL（a），DPPH· scavenging rate IC50 values（b）and amino acid analysis of papain protease solution（c）

2.3 交互作用產(chǎn)物活性評價

2.3.1 交互作用產(chǎn)物XOD抑制活性 從圖3可知，17 μg/mL土茯苓黃酮和11 mg/mL鰹魚蛋白肽XOD抑制率相當(dāng)，說明土茯苓黃酮的XOD抑制活性高于鰹魚蛋白肽，交互作用后XOD抑制率（47.35%）比黃酮和多肽分別測得XOD活性顯著升高（P<0.05），說明交互作用有助于提升XOD抑制活性。由于低質(zhì)量濃度下，土茯苓黃酮和鰹魚蛋白肽具有很高的DPPH·清除活性，且雙酶偶聯(lián)法所用XOD質(zhì)量濃度高。因此，以DPPH·清除活性做進一步交互作用的研究。

2.3.2 交互作用產(chǎn)物DPPH·清除活性 由圖4可知，5 μg/mL土茯苓黃酮與2 mg/mL鰹魚蛋白肽的活性相當(dāng)，說明黃酮的DPPH·清除活性明顯優(yōu)于多肽；在土茯苓黃酮質(zhì)量濃度小于9 μg/mL時，質(zhì)量濃度增加其與鰹魚蛋白肽交互作用后所得產(chǎn)物的活性顯著高于兩者所測得活性的數(shù)值總和（P<0.05），說明交互作用有助于提高DPPH·清除活性。當(dāng)土茯苓黃酮質(zhì)量濃度達到11 μg/mL時，交互作用后產(chǎn)物的活性與兩者所測得活性的數(shù)值總和之間無顯著性差異，原因是酚羥基在高質(zhì)量濃度下與肽鏈間的結(jié)合方式發(fā)生改變[20]，從而引起活性的變化。

圖3 交互作用后XOD抑制活性Fig.3 XOD inhibition activities of flavonoids-peptide complexes

2.3.3 交互作用產(chǎn)物抗氧化穩(wěn)定性 由圖5a可知，兩者交互作用后活性顯著升高（P<0.01），多肽、黃酮及交互作用產(chǎn)物在巴氏殺菌條件下相對穩(wěn)定，然而對高溫敏感，121℃加熱有助于提高多肽活性，而黃酮和交互作用產(chǎn)物高溫處理后活性顯著降低（P<0.05），這是因為高溫使多肽鏈?zhǔn)軣嵫诱?，?nèi)部疏水基團暴露，活性增強，而黃酮中酚羥基可能被氧化，導(dǎo)致活性降低。

因此，普通巴氏殺菌不會影響產(chǎn)品的抗氧化活性，高溫長時滅菌雖會影響產(chǎn)品抗氧化活性，但其活性仍處于較高水平。工業(yè)生產(chǎn)時，建議采用巴氏殺菌保持產(chǎn)品活性最高，為延長產(chǎn)品貨架期也可采用高溫長時滅菌。

圖4 交互作用后DPPH·清除活性Fig.4 DPPH·scanvenging activities of flavonoids-peptide complexes

由圖5b可知，交互作用后活性顯著升高（P<0.01），多肽對pH敏感，pH升高活性降低，在pH 6.5時活性顯著下降（P<0.05）；與此不同的是，黃酮和交互作用產(chǎn)物隨溫度變化活性先升后降，pH 6.0時活性最高，因此通過控制產(chǎn)品pH值為6.0使其抗氧化活性達到最高。

2.4 土茯苓黃酮提取物與鰹魚蛋白肽交互作用

按照1.3.8節(jié)方法分別測定了298 K和310 K條件下，土茯苓黃酮提取物（Flavonoids）對鰹魚蛋白肽（BPH）的熒光猝滅光譜如圖6所示。

由圖6b可知，鰹魚蛋白肽在350 nm波長處熒光吸收光譜，且作為熒光供能體使圖6a中Tris-HCl吸收峰值增大，然而未改變其出峰位置和峰形。

圖5 溫度（a）和pH（b）對DPPH·清除活性的影響Fig.5 The influence of temperature（a）and pH（b）on DPPH· scavenging activity

由圖6c和6d可知，土茯苓黃酮在350 nm波長處具有熒光吸收，說明黃酮中含有少量蛋白，且在460 nm波長處本身具有吸收峰；質(zhì)量濃度低于160 μg/mL時，熒光吸收強度與質(zhì)量濃度之間成劑量依賴關(guān)系，而質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，350 nm波長處的熒光吸收峰紅移且強度增大，原因可能是濃度升高，蛋白質(zhì)聚集或與黃酮類物質(zhì)形成聚合物，苯環(huán)上取代基發(fā)生變化導(dǎo)致吸收峰紅移。

由圖6e可知，在質(zhì)量濃度低于20 μg/mL時，黃酮對多肽的光猝滅效果不明顯；與此不同的是，質(zhì)量濃度高于40 μg/mL時猝滅效果顯著，且吸收峰紅移。蛋白質(zhì)和多肽在350 nm波長處的熒光發(fā)射基團主要是色氨酸[21]，低質(zhì)量濃度的黃酮能與多肽結(jié)合的分子數(shù)目少，當(dāng)其猝滅強度與提取物中蛋白質(zhì)熒光吸收強度相當(dāng)時，導(dǎo)致無熒光猝滅；高質(zhì)量濃度黃酮分子數(shù)目多，使其猝滅強度超過自身蛋白熒光吸收強度，且與多肽鏈的結(jié)合方式也有所不同，色氨酸中苯環(huán)的取代基基團和位置變化，吸收峰紅移。

圖6 Tris-HCl熒光吸收光譜（a）；不同濃度鰹魚蛋白肽熒光吸收光譜（b）；土茯苓黃酮熒光吸收光譜（c）和（d）；交互作用產(chǎn)物熒光吸收光譜（e）和（f）Fig.6 The fluorescence absorption spectrum of Tris-HCl（a）；The fluorescence absorption spectrum of different concentrations of bonito protein peptide（b）；The fluorescence absorption spectrum of flavonoids（c）and flavonoids-peptide（e）and（f）

由圖6f可知，溫度變化并未引起交互作用產(chǎn)物吸收峰值和峰形的變化，因此黃酮對多肽的猝滅為靜態(tài)猝滅，說明交互作用可能形成了新的復(fù)合物。結(jié)合氨基酸分析，多肽的脯氨酸可能與黃酮中的酚羥基通過氫鍵結(jié)合或與疏水性的芳香基團產(chǎn)生疏水相互作用聚集，且交互作用在高溫下活性顯著降低，說明土茯苓黃酮與鰹魚蛋白肽可能通過氫鍵結(jié)合成新產(chǎn)物。

3 結(jié)論

醇提土茯苓黃酮提取率及化學(xué)活性顯著高于水提土茯苓黃酮，木瓜蛋白酶酶解液蛋白質(zhì)回收率高且活性強。兩者交互作用后XOD抑制活性顯著升高（P<0.05），DPPH·清除活性出現(xiàn)協(xié)同增效效果。高溫121℃加熱20 min使交互作用產(chǎn)物DPPH·清除活性顯著降低（P<0.05），且 pH 6.0時其活性最佳。土茯苓黃酮對鰹魚蛋白肽具有顯著的靜態(tài)猝滅。熒光光譜法和氨基酸分析表明，土茯苓黃酮與鰹魚蛋白肽之間可能通過氫鍵形成了新的復(fù)合物，使其XOD抑制活性和DPPH·清除活性升高，這為中草藥與多肽復(fù)合產(chǎn)品的生產(chǎn)和研究提供了科學(xué)依據(jù)。