潘孝貴, 金其貫, 李 蕾

(1.西華師范大學 體育學院,四川 南充 637002; 2.揚州大學 體育學院,江蘇 揚州 225127; 3.淮北師范大學 體育學院,安徽 淮北 235000)

精氨酸/一氧化氮(L-Arg/NO)途徑介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能是高血壓發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要環(huán)節(jié)。研究[1]表明,僅1%的內(nèi)皮功能提高,就可將高血壓等心血管病人危險性降低13%。含L-Arg殘基蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)L-Arg甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)催化下生成的甲基化L-Arg,如不對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethyl arginine,ADMA),對內(nèi)皮細胞L-Arg/NO通路的關鍵酶——內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)具有明確的抑制作用,被認為是新的心血管危險因子[2]。ADMA生成后,絕大部分在二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(dimethyl arginine dimethyl aminohydrolase,DDAH)催化下水解成左旋瓜氨酸(L-Citrulline,L-Cit)和二甲胺,少部分通過腎臟進行排泄[3]。Cit也可以作為L-Arg內(nèi)源合成的前體物質(zhì),提高機體L-Arg水平。L-Arg在NOS催化下,生成NO,參與血流動力學穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。研究[4]表明,激活PRMT或抑制DDAH活性,造成ADMA合成增多或水解減少,導致體內(nèi)ADMA堆積,可以極大地抑制eNOS活性,進而引起NO生物利用度下降;補充L-Arg,或Cit、天冬氨酸、蘋果酸等L-Arg前體可以顯著提高NO含量[5]。因此,PRMT/ADMA-DDAH/Cit-eNOS/NO組成的通路,成為高血壓等心血管疾病重要的干預靶點。流行病學、動物實驗、臨床報道都證實,運動尤其是規(guī)律性有氧運動,可顯著降低原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)患者血壓,改善內(nèi)皮功能和心功能[6],但PRMT/ADMA-DDAH/Cit-eNOS/NO通路在運動降血壓和改善心功能過程中扮演何種角色鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 選用8周齡雄性SHR大鼠50 只,隨機分為5組:0周對照組(C-0,n=10)、4周對照組(C-4,n=10)、8周對照組(C-8,n=10)、4周運動組(E-4,n=10)、8周運動組(E-8,n=10),均由北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]提供。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食、活動,室內(nèi)溫度為22～24 ℃,濕度為40%～60%。運動組在最后1次運動結(jié)束24 h后處死,禁食12 h。

運動干預采用自主游泳方式。游泳條件:塑鋼游泳池(150 cm×60 cm×70 cm ),水深為大鼠身體長度的2倍,水溫保持在31～33 ℃。所有大鼠進行3 d適應性游泳訓練后,E-4和E-8分別完成連續(xù)4周或8周的游泳。訓練方案:6 d/周,60 min/d,負重3% bw。對照組不進行任何訓練,常規(guī)分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 SYBR Green Master(ROX)試劑盒(購自Roche Diagnostics),PRMT-1、DDAH-2和GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司設計并合成,引物序列見表1。其他試劑為市售分析純產(chǎn)品。

表1 PRMT-1、DDAH-2、GAPDH引物序列

1.2 方法

1.2.1 血壓和心功能測定 血壓采用體積壓力傳感器技術(VPR),尾套管法測量大鼠尾動脈,設備為CODATM8多通道無創(chuàng)血壓系統(tǒng)( Kent,USA),基本過程見文獻[7]。每2周1次,重復2遍,取平均值。

心功能測量采用二維彩超(高分辨率小動物超聲系統(tǒng)Vevo 770TM,Canada),由南京醫(yī)科大學超聲醫(yī)學科專業(yè)人員操作,基本過程見文獻[8]。根據(jù)ASE推薦法測定,經(jīng)Simpson法換算,最終參數(shù)包括射血分數(shù)(eject fiction,EF)、短軸縮短分數(shù)(fractional shortening,FS)、左心室質(zhì)量(left ventricle mass,LVM)、左心室舒張末期容積(left ventricle end diastolic volume,LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricle end systolic volume,LVESV)、每搏輸出量(stroke volume,SV)[9]。

1.2.2 心肌ADMA、Cit、L-Arg、NO含量及eNOS活性測定 心肌勻漿制備:取200 mg心肌組織,濾紙吸干,用組織搗碎機在冰水中以10 000～15 000 r/min速度上下研磨,制成10%組織勻漿,低速離心,取上清液待檢。心肌ADMA、Cit、L-Arg含量測定:采用高效液相色譜法,儀器為Agilent Technologies 1200 Series 高效液相色譜儀。標準品購自Sigma-aldrich公司(上海),基本過程參照文獻[10]。心肌NO含量測定:以組織中硝酸鹽和亞硝酸鹽總含量間接表示NO含量。檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司,嚴格按說明書操作。心肌eNOS活性測定:采用格里斯試劑法,在530 nm波長下比色,檢測試劑盒為一氧化氮合成酶(NOS)分型測試盒,購自南京建成生物工程公司,嚴格按說明書操作。

1.2.3 心肌PRMT-1、DDAH-2及GAPDH mRNA水平測定 取約100 mg的心肌組織放入含有1 mL預冷RNAiso Plus的研磨管中,用組織勻漿器以6 (mol·L-1)/s速度勻漿1 min,提取總RNA后,采用NanoDrop ND-3300微量分光光度計檢測260/280吸光度比值,判斷RNA純度。按照cDNA合成試劑盒說明書的要求去除基因組DNA后,使用2720 Thermal Cycler梯度PCR儀(美國)進行cDNA合成,反應結(jié)束后,在-20 ℃條件下保存。RNAiso Plus和cDNA合成試劑盒購自寶生物(TaKaRa)工程有限公司。

PRMT-1、DDAH-2 mRNA采用RT-qPCR測定,以cDNA為模板,GAPDH為內(nèi)參,在ABI 7500 RT-PCR儀中進行基因擴增。擴增程序為:50 ℃預處理2 min,95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,共進行40個循環(huán)。程序運行結(jié)束后,將目的基因的CT值與內(nèi)參GAPDH進行標準化,計算出目的基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理。先進行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗,后進行單因素方差分析,采用LSD法進行組間兩兩比較,結(jié)果以MSD表示。統(tǒng)計學顯著水平為P< 0.05,高度顯著性水平為P< 0.01。

2 結(jié)果

2.1 血壓和心功能指標如表2所示,與C-0組比較,C-4、C-8組SBP、DBP、LVM、LVEDV、LVESV、SV顯著升高(P<0.05),E-4、E-8組SBP、DBP、LVM、LVESV顯著降低(P<0.05),EF、FS、LVEDV、SV顯著升高(P<0.05);E-4、E-8組SBP、DBP、LVM、LVESV顯著低于同周齡的C-4、C-8組(P<0.05),EF、FS、SV顯著高于同周齡的C-4、C-8組(P<0.05);E-8組與E-4組比較,SBP、DBP、EF、SV無顯著性差異,FS、LVM、LVEDV、LVESV顯著升高(P<0.05)。

表2 血壓和心功能指標比較(M±SD)

注:1 mmHg=133.3 Pa;表示與C-0組比較P<0.05,表示與C-0組比較P<0.01;*表示與同周齡對照組比較P<0.05,**表示與同周齡對照組比較P<0.01;&表示與E-4組比較P<0.05;&&表示與E-4組比較P<0.01。

2.2 心肌ADMA、Cit、L-Arg、NO含量及L-Arg/ADMA比值、eNOS活性如圖1所示,與C-0組比較,C-8組心肌ADMA含量顯著升高(P<0.05),Cit含量、L-Arg/ADMA比值顯著下降(P<0.05),E-4組Cit顯著降低NO含量顯著升高(P<0.01),E-8組ADMA含量顯著降低(P<0.01),L-Arg、NO含量,以及L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高(P<0.05)。與同周齡對照組比較,E-4組 Cit含量顯著降低(P<0.01),NO含量顯著升高(P<0.05),E-8組Cit、ADMA含量顯著降低(P<0.01),L-Arg、NO含量,以及L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高(P<0.05)。與E-4組比較,E-8組ADMA含量顯著降低(P<0.01),Cit、NO含量、L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高(P<0.05)。

2.3 心肌PRMT-1、DDAH-2 mRNA表達如圖2所示,與C-0組比較,C-8組PRMT-1 mRNA表達顯著升高,DDAH-2 mRNA表達顯著降低(P<0.05),但E-4、E-8組PRMT-1 mRNA表達顯著降低(P<0.01),DDAH-2 mRNA表達顯著升高(P<0.01)。與同周齡C-4、C-8組比較,E-4組DDAH-2 mRNA表達顯著提高(P<0.01),E-8組PRMT-1 mRNA表達顯著降低(P<0.01),DDAH-2 mRNA表達顯著升高(P<0.05)。與E-4組比較,E-8組PRMT-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。

注:表示與C-0組比較P<0.05,表示與C-0組比較P<0.01;*表示與同周齡對照組比較P<0.05,**表示與同周齡對照組比較P<0.01;&表示與E-4組比較P<0.05;&&表示與E-4組比較P<0.01。

圖1 心肌ADMA、Cit、L-Arg、NO含量及L-Arg/ADMA比值、eNOS活性
Figure 1 Content of ADMA,Cit,L-Arg,NO and L-Arg/ADMA,eNOS activity in SHR myocardium

注:表示與C-0組比較P<0.05,表示與C-0組比較P<0.01;*表示與同周齡對照組比較P<0.05,**表示與同周齡對照組比較P<0.01;&表示與E-4組比較P<0.05;&&表示與E-4組比較P<0.01。

圖2 心肌PRMT-1、DDAH-2 mRNA表達
Figure 2 Relative expression of myocardial PRMT-1,DDAH-2 mRNA in SHR

3 討論

本文發(fā)現(xiàn),隨著周齡的增加,C-4、C-8組 SHR收縮壓、舒張壓顯著高于C-0組,且C-8組SHR顯著高于C-4組,均達到輕中度高血壓標準[SBP≥140 mmHg(18.66 kPa)/DBP≥100 mmHg(13.33 kPa)]。研究[11]表明,對輕中度高血壓患者而言,僅靠有規(guī)律的運動即可有效降低或控制血壓。經(jīng)運動干預后,E-4、E-8組SHR收縮壓、舒張壓顯著低于C-4、C-8組,但E-8與E-4組比較,收縮壓、舒張壓無顯著性差異。提示,4周到8周的游泳運動可以有效降低甚至逆轉(zhuǎn)SHR大鼠血壓。本文中,降壓幅度較大,可能與SHR周齡較小,靶器官尚無嚴重的器質(zhì)性損傷有關。研究[12]表明,運動干預可以有效降低高血壓患者血壓,但對常壓者血壓無顯著性影響。4周運動干預后,SHR收縮壓略高于120 mmHg(15.996 kPa),舒張壓略高于100 mmHg(13.33 kPa),屬于高血壓前期或高值血壓,因此,持續(xù)更久的8周運動干預并未進一步降低SHR大鼠血壓。

心臟既是血壓的調(diào)節(jié)器官,又是高血壓損害的靶器官,慢性高血壓患者常伴有心功能損傷。臨床實驗、動物實驗、流行病學均證實,運動在降低高血壓患者血壓的同時,可改善心功能,減輕心肌肥厚程度[13]。本文通過動物無創(chuàng)二維彩超心動圖測試發(fā)現(xiàn),C-4、C-8組SHR的LVM、LVEDV、LVESV、SV顯著高于C-0組,表明隨著周齡的增加,SHR大鼠血壓升高,發(fā)生心肌肥大,LVEDV和LVESV均擴大,SV顯著升高,但EF無顯著提高。與同周齡的對照組比較,E-4、E-8組SHR大鼠EF、FS、LVS、SV顯著升高,LVM、LVS顯著降低,表明運動干預提高了SHR大鼠心肌收縮能力,增強了心臟泵血機能,降低了心肌肥大程度。與E-4組比較,E-8組EF、FS、LVM、LVD、LVS顯著升高,但SV無顯著性差異,說明堅持更長時間的運動干預,可進一步提高SHR心肌收縮力,并將SV保持在較高水平。

血壓的形成與心臟泵血機能和外周阻力密切相關,凡影響這2個方面的因素均可以影響血壓。心肌組織血管非常豐富,冠脈系的各級動脈腔面、心內(nèi)膜表面均覆蓋有內(nèi)皮。心臟內(nèi)皮通過L-Arg/NO途徑合成適量的NO,參與血管舒張、心肌負性變時和負性變力,維持正常心功能,調(diào)節(jié)血壓等血流動力學參數(shù)。研究[14]證實,SHR大鼠心血管組織eNOS表達下調(diào),血漿和組織L-Arg、NO含量顯著低于野生型Wky大鼠,說明 L-Arg/NO通路抑制是SHR重要的心血管代謝特征。L-Arg/NO通路參與血壓調(diào)節(jié)的關鍵是NO生物利用度。從物質(zhì)代謝角度看,NO生物利用度主要受底物(L-Arg)水平、調(diào)節(jié)酶(eNOS)活性和產(chǎn)物(NO)淬滅的影響[15]。L-Arg作為條件必需氨基酸,是NO內(nèi)源性合成的唯一前體,消耗的L-Arg約占總量的1%～2%。SHR大鼠心肌組織存在L-Arg合成相關的酶系,可以內(nèi)源合成L-Arg,也可以通過陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運載體-1(cationic amino acid transporter-1,CAT-1)從血液中攝取[16]。ADMA是新發(fā)現(xiàn)的eNOS內(nèi)源性抑制劑,已經(jīng)被認為是獨立的心血管危險因素和內(nèi)皮損傷因子[3]。ADMA抑制eNOS活性的機制可能與eNOS解耦聯(lián)、自由基激活有關[17]。研究[18]表明,SHR大鼠血漿和心肌ADMA含量隨周齡顯著升高。ADMA主要來自蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)催化的含L-Arg殘基蛋白質(zhì)水解[2]。ADMA生成后,絕大部分在DDAH催化下水解成L-Cit和二甲胺,少部分通過腎臟排泄[3]。PRMT是促進ADMA合成最主要的酶類,而DDAH是水解ADMA最主要的酶類。這2種酶具有多種亞型,心血管組織主要表達PRMT-1和DDAH-2。NO不斷生成的同時,也不斷被自由基淬滅。SHR大鼠氧化應激水平顯著高于野生型Wky大鼠,是其NO生物利用度低下的重要原因。ADMA與自由基在加速組織NO淬滅方面有協(xié)同作用[19]。

本文結(jié)果顯示,與C-0組比較,C-4組心肌L-Arg、ADMA、Cit、NO含量,以及L-Arg/ADMA比值、eNOS活性、PRMT-1mRNA、DDAH-2表達均無顯著變化,但C-8組ADMA含量、PRMT-1mRNA表達顯著提高,Cit含量、L-Arg/ADMA比值和DDAH-2mRNA表達顯著下降,L-Arg、NO含量無顯著變化。提示,在SHR增齡性血壓升高過程中,心肌L-Arg水平可能并不是SHR血壓升高的限制性因素;隨著周齡的增加,到16周齡時,處于輕中度高血壓階段的SHR心肌PRMT-1mRNA表達上調(diào),加速ADMA生成,同時DDAH-2mRNA表達下降,減少ADMA分解,進而造成心肌ADMA堆積,L-Arg/ADMA比值降低。心肌Cit含量下降間接提示,高血流動力學壓力下,SHR心肌物質(zhì)代謝加速,通過Cit途徑合成L-Arg,拮抗ADMA的抑制效應,從而代償性增強eNOS合成NO的能力。綜合以上2個方面因素,盡管4周、8周時SHR大鼠血壓升高、心功能輕度受損,但心肌eNOS活性和NO含量并未發(fā)生顯著變化,這與長期、重度高血壓個體eNOS活性和NO含量顯著降低有著較大不同。這些結(jié)果表明,心肌PRMT-1/ADMA-DDAH-2/Cit-eNOS/NO通路在SHR增齡引起的輕中度高血壓和心功能損傷過程中扮演著一定的角色,但可能還有其他重要因素參與,如縮血管物質(zhì)(ET-1、Ang-II等)、交感神經(jīng)緊張性過高等神經(jīng)-體液因素,及腎性因素[6]。

運動干預對心血管組織最顯著的影響是提高組織器官的血流動力學水平。運動過程中,心肌收縮力增強,心率加快,冠脈擴張,冠脈血流量顯著增加,血管內(nèi)皮反復暴露于高切應力環(huán)境,極大地激活和上調(diào)eNOS表達,加強NO合成。NO通過抗動脈硬化、抗感染、抗血栓3個途徑,參與血流動力學穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。交感神經(jīng)激活造成的高血壓與腎組織ADMA含量存在著密切聯(lián)系[20]。人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)實驗表明,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)損傷內(nèi)皮的機制可能與抑制DDAH活性,提高ADMA含量有關[21]。降低交感神經(jīng)緊張性和血漿ox-LDL水平,均是已經(jīng)得到確認的運動降血壓和改善內(nèi)皮功能的機制,因此,ADMA很可能是運動干預原發(fā)性高血壓等心血管疾病的重要靶點物質(zhì)。運動訓練對穩(wěn)定的心血管病人血管內(nèi)皮具有顯著的改善效應,并可部分糾正其心血管失衡,提高左心功能[22]。Graziano[23]發(fā)現(xiàn),堅持每天跑臺行走3 000 m,可以顯著降低中老年心血管病患者血漿ADMA、SDMA含量,升高血漿L-Arg含量。景志強等[24]發(fā)現(xiàn),持續(xù)10周,每周5次,每次40 min的跑臺運動,可以極大地降低糖尿病大鼠血漿ADMA水平,且與降糖藥——羅格列酮有協(xié)同作用,其機制可能與肝臟DDAH表達上調(diào)有關。周亮等[25-26]認為中等強度以上的有氧運動改善雄性SD大鼠動脈粥樣硬化的機制與降低血清ADMA水平有關,且較長時間、較大強度的有氧運動效果更佳。張靚等[27]也認為運動改善Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化的機制可能與降低ADMA水平有關,而與L-Arg水平無關。

本文發(fā)現(xiàn),與C-0組比較,E-4組心肌NO含量顯著升高,Cit含量、PRMT-1mRNA表達顯著降低,DDAH-2mRNA表達顯著升高;E-8組心肌ADMA含量顯著降低,L-Arg、NO含量,以及L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高,PRMT-1mRNA表達顯著降低,DDAH-2mRNA表達顯著升高;與C-4組比較,E-4組Cit顯著降低,NO顯著升高,DDAH-2mRNA表達顯著提高;與C-8組比較,E-8組Cit、ADMA顯著降低,L-Arg、NO含量,以及L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高,PRMT-1mRNA表達顯著降低,DDAH-2mRNA表達顯著升高。與E-4組比較,E-8組ADMA顯著降低,Cit、NO含量、L-Arg/ADMA比值和eNOS活性顯著升高,PRMT-1mRNA表達水平顯著降低。4周運動干預后,SHR大鼠血壓恢復接近正常水平的同時,通過下調(diào)心肌PRMT-1mRNA、上調(diào)DDAH-2mRNA表達,抵消增齡誘導的心肌ADMA堆積對eNOS的抑制,促進NO合成。繼續(xù)進行運動干預,盡管血壓未能進一步下降,但SHR心肌PRMT-1mRNA表達顯著降低、DDAH-2mRNA表達顯著提高的同時,ADMA顯著下降,L-Arg及L-Arg/ADMA比值顯著升高,eNOS活性增強,NO合成顯著增加,心功能進一步改善。因此,規(guī)律性運動可能通過干預輕中度高血壓SHR心肌PRMT-1/ADMA-DDAH-2/Cit-eNOS/NO通路的一個或幾個組分,參與血管舒張、心肌負性變時和負性變力,改善心功能,調(diào)節(jié)血壓等血流動力學參數(shù),長期運動干預較短期對該通路的影響更明顯、更廣泛。本文結(jié)果也提示,即使血壓恢復正常,繼續(xù)運動干預可改善原發(fā)性高血壓個體心肌L-Arg代謝。

長期規(guī)律性運動下調(diào)心肌PRMT-1mRNA的機制,可能與PRMT-1mRNA催化的L-Arg甲基化過程屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾,通過抑制或促進蛋白質(zhì)之間相互作用而影響信號轉(zhuǎn)導有關[28]。運動訓練上調(diào)心肌組織DDAH-2mRNA表達的機制,則可能與ADMA堆積誘導的底物激活效應有關[29],也可能與運動訓練降低高血壓患者心血管組織血管緊張素-II分泌有關。已有研究證實,血管緊張素-II可以誘導ADMA生成[30]。運動過程中氧耗量較高,物質(zhì)代謝旺盛,神經(jīng)-體液分泌活躍,蛋白質(zhì)處于不斷合成和降解中,氨基酸特別是L-Arg和谷氨酰胺,大量從骨骼肌中被動員出來,以加強NO和還原型谷胱甘肽(GSH)合成,調(diào)整心血管組織的物質(zhì)代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路,降低組織氧化應激水平,調(diào)節(jié)心血管患者內(nèi)皮功能,但具體機制還需要進一步研究。

4 結(jié)論

SHR增齡性血壓升高和心功能損傷的同時,心肌PRMT/ADMA-DDAH/Cit-eNOS/NO通路受到影響,PRMT-1mRNA表達上調(diào),DDAH-2mRNA表達下降,ADMA堆積,Cit含量和L-Arg/ADMA比值降低。運動通過下調(diào)心肌PRMT-1mRNA和/或上調(diào)DDAH-2mRNA表達,減少ADMA堆積,升高L-Arg/ADMA比值,增強eNOS活性,提高NO含量,從而改善心功能。