魏歡　吳菲　于萍　毛蘭群

摘?要?化學(xué)物質(zhì)參與腦內(nèi)信息傳遞以及與腦神經(jīng)相關(guān)的各種生理和病理過(guò)程，因此，腦神經(jīng)化學(xué)的研究受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。電化學(xué)分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)腦內(nèi)重要神經(jīng)分子的活體原位和活體在線(xiàn)分析，因而在腦神經(jīng)生理病理過(guò)程的研究中具有重要意義。其中，利用酶、核酸適配體等生物識(shí)別元件，合理設(shè)計(jì)電極/溶液傳感界面，進(jìn)而研制出高選擇性和高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器，將為腦化學(xué)的活體分析提供重要的途徑。本文對(duì)電化學(xué)生物傳感器在腦化學(xué)活體分析中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)述，并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?電化學(xué)生物傳感器; 活體分析; 活體原位傳感; 活體在線(xiàn)分析; 腦化學(xué); 評(píng)述

1?引 言

作為高級(jí)神經(jīng)中樞，大腦是運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、情感等生命活動(dòng)的中心。因此，腦科學(xué)的研究對(duì)于理解和認(rèn)識(shí)各種神經(jīng)生理和病理過(guò)程的本質(zhì)具有極其重要的意義。腦功能的神經(jīng)信號(hào)傳遞絕大多數(shù)需要多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的共同參與，包括神經(jīng)遞質(zhì)（如兒茶酚胺、谷氨酸、γ?氨基丁酸、乙酰膽堿、神經(jīng)肽等）、神經(jīng)調(diào)質(zhì)（如抗壞血酸等）、能量物質(zhì)（如葡萄糖、乳酸、ATP等）、離子（如H+、K+、Na+、Ca2+、Cl

等）以及其它重要的神經(jīng)分子（如H2O2、H2S、NO等）[1，2]。因此，建立和發(fā)展新的分析化學(xué)的原理和方法，在活體層次實(shí)現(xiàn)腦化學(xué)的動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)，將極大推動(dòng)對(duì)腦功能和腦疾病分子機(jī)制的研究。

目前，用于活體層次的分析和成像技術(shù)主要包括電化學(xué)方法、熒光成像[3]、質(zhì)譜成像（Imaging mass spectrometry， IMS）[4]、磁共振成像（Magnetic resonance imaging， MRI） [5]、磁共振腦功能成像（Functional magnetic resonance imaging， fMRI）[6]、磁共振波譜（Magnetic resonance spectroscopy， MRS）[7]、正電子發(fā)射斷層掃描（Positron emission tomography， PET）[8]和單光子發(fā)射斷層掃描（Single photon emission computed tomography， SPECT）[9]等。與電化學(xué)分析方法相比，這些成像技術(shù)具有無(wú)損的優(yōu)勢(shì)，但是它們常需使用一些特殊的化學(xué)試劑作為探針，可分析的神經(jīng)分子種類(lèi)較少，且時(shí)空分辨率較低。電化學(xué)分析方法因其具有高時(shí)空分辨、可實(shí)現(xiàn)活體、原位、實(shí)時(shí)以及多組分同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)分析化學(xué)的研究中備受關(guān)注[10～22]，已被成功應(yīng)用于腦內(nèi)部分重要神經(jīng)分子（如多巴胺、抗壞血酸等）的活體分析[23～33]。

生物傳感器誕生于1962年，Clark等[34]率先提出了酶?jìng)鞲衅鞯母拍?。自第一支酶電極問(wèn)世以來(lái)，隨著物理、化學(xué)原理及方法的不斷引入，生物傳感器的研究已發(fā)展成為一個(gè)多學(xué)科高度交叉與融合的前沿領(lǐng)域之一[35]。電化學(xué)生物傳感器通過(guò)對(duì)電極表面進(jìn)行功能化修飾的基礎(chǔ)上，識(shí)別元件將待測(cè)分子轉(zhuǎn)化為電化學(xué)可檢測(cè)的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)濃度的選擇性定量分析[36，37]。按生物識(shí)別元件分類(lèi)，電化學(xué)生物傳感器可分為酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、DNA傳感器、微生物傳感器等。由于其高的選擇性和表界面設(shè)計(jì)的多樣性，生物電化學(xué)傳感器在腦化學(xué)活體分析中展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其中酶?jìng)鞲衅饔捎谔禺愋愿?、響?yīng)時(shí)間短，特別適用于活體分析。本文針對(duì)腦內(nèi)電化學(xué)活性相對(duì)較差的分子，如能量物質(zhì)（葡萄糖、乳酸、ATP）、神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺，谷氨酸、乙酰膽堿）等，按照不同的識(shí)別機(jī)理，分別對(duì)基于氧化酶、脫氫酶、漆酶、谷氨酸合成酶、核酸適配體（Aptamer）及多酶協(xié)同的電化學(xué)生物傳感器在活體分析中的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

2?基于氧化酶電化學(xué)生物傳感器的活體分析

2.1?第一代氧化酶型生物傳感器

第一代氧化酶型生物傳感器是利用O2作為氧化酶的電子受體，通過(guò)檢測(cè)酶催化反應(yīng)過(guò)程中H2O2的生成量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)被測(cè)物濃度及其變化的傳感分析。盡管目前大部分氧化酶型生物傳感器是基于該原理研制而成，但是該類(lèi)生物傳感器仍面臨諸多問(wèn)題[38]。一方面，O2作為酶催化反應(yīng)的電子受體，其濃度隨環(huán)境的波動(dòng)將會(huì)影響傳感器信號(hào)的穩(wěn)定性; 另一方面，H2O2的電化學(xué)氧化通常具有較高的過(guò)電位，而腦內(nèi)共存的其它物種，如多巴胺及其代謝產(chǎn)物、抗壞血酸等，在此高電位下也能發(fā)生電化學(xué)氧化反應(yīng)，進(jìn)而干擾測(cè)定; 雖然檢測(cè)H2O2的還原電流能夠避免以上物質(zhì)氧化的干擾，但由溶解氧電化學(xué)還原而產(chǎn)生的干擾仍是一個(gè)不可回避的問(wèn)題[39]。

為了提高第一代氧化酶型生物傳感器的選擇性，研究人員曾在傳感器的表面再覆蓋一層離子交換膜[40]或者電化學(xué)聚合膜[41]，從而抑制電化學(xué)活性物質(zhì)（如抗壞血酸）向電極表面的擴(kuò)散和的電化學(xué)氧化?？箟难釋?duì)于傳感器的干擾也可通過(guò)在電極表面或在線(xiàn)電化學(xué)傳感器上游引入抗壞血酸氧化酶修飾層或酶柱，預(yù)先氧化抗壞血酸進(jìn)而消耗其含量實(shí)現(xiàn)[42]。Baker等[43]在鉑微電極表面電聚合鄰苯二胺薄膜，并修飾以甲基丙烯酸甲酯、醋酸纖維素等作為穩(wěn)定劑，結(jié)合生物識(shí)別元件（膽堿氧化酶）實(shí)現(xiàn)了大鼠腦內(nèi)膽堿的原位電化學(xué)分析。Li等[44]通過(guò)在葡萄糖氧化酶修飾的電極上電聚合一層鄰苯二胺薄膜，提高了對(duì)葡萄糖的選擇性，并將該陣列電極成功用于大鼠擴(kuò)散性抑制（Spreading depression，SD）過(guò)程中葡萄糖、O2和電生理活動(dòng)的同時(shí)測(cè)定。他們發(fā)現(xiàn)，在SD過(guò)程中，腦內(nèi)葡萄糖和氧分壓會(huì)發(fā)生明顯的變化。Chatard等[45]利用氣相沉積的方法在直徑7 μm的碳纖維表面鍍鉑，再電聚合一層間苯二胺薄膜，較好地抑制了內(nèi)源性電活性分子向電極表面的擴(kuò)散。通過(guò)使用葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶，他們研制出了對(duì)腦組織創(chuàng)傷較小，但對(duì)于葡萄糖和乳酸具有良好響應(yīng)的活體電化學(xué)生物傳感器，成功用于腦神經(jīng)生理病理模型中葡萄糖和乳酸動(dòng)態(tài)變化的研究。他們還發(fā)現(xiàn)，在SD過(guò)程中，傳統(tǒng)微電極和碳纖維微電極對(duì)葡萄糖和乳酸的響應(yīng)表現(xiàn)出較大差異。

除上述方法外，背景扣除的方法也能消除干擾。Gerhardt研究組[46～48]在陣列電極上設(shè)計(jì)自參照電極，將其電流信號(hào)作為背景信號(hào)，在具體的分析測(cè)定中予以扣除，這種方法可消除在相同的極化電位下其它物質(zhì)對(duì)谷氨酸氧化酶修飾電極的干擾。他們首先在電極表面修飾一層Nafion，避免抗壞血酸的干擾; 隨后，利用戊二醛和牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）交聯(lián)法將谷氨酸氧化酶固定至陣列電極表面，用于記錄氧化電流的總和; 相鄰的自參照位點(diǎn)僅修飾BSA和戊二醛，用于記錄背景氧化電流。二者電流之差用于谷氨酸的定量分析（圖1A）。他們利用局部注射谷氨酸的模型，成功地將該生物傳感器用于鼠腦谷氨酸活體原位的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并實(shí)現(xiàn)了自由活動(dòng)大鼠在靜息狀態(tài)及應(yīng)激壓力下腦內(nèi)谷氨酸的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)（圖1B）。

在活體電化學(xué)分析中，除利用微電極技術(shù)而發(fā)展的活體原位電化學(xué)分析方法外，還有一類(lèi)是基于微透析取樣技術(shù)的活體分析方法。電化學(xué)生物傳感器不僅可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)分子的活體原位傳感分析，而且也可作為高選擇性的檢測(cè)器，通過(guò)結(jié)合微透析取樣技術(shù)，實(shí)現(xiàn)腦化學(xué)的活體在線(xiàn)分析。

微透析取樣技術(shù)自1972年問(wèn)世以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、藥學(xué)和分析化學(xué)等多學(xué)科的研究中[49]。作為活體取樣技術(shù)，該技術(shù)一般需要結(jié)合樣品分離和檢測(cè)，方可實(shí)現(xiàn)與腦化學(xué)相關(guān)的研究。電化學(xué)生物傳感器由于具有高選擇性和傳感界面設(shè)計(jì)多樣性等優(yōu)點(diǎn)，因此微透析技術(shù)和高選擇性生物電化學(xué)傳感的有效結(jié)合，可形成活體在線(xiàn)電化學(xué)分析系統(tǒng)（Online electrochemical system，OECS），實(shí)現(xiàn)部分神經(jīng)分子（如葡萄糖、乳酸、谷氨酸等）的直接檢測(cè)[50]。相對(duì)于使用樣品分離的離線(xiàn)分離分析，OECS具有時(shí)間分辨率高、樣品保真、易與行為學(xué)研究相結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)[51]。但是，無(wú)需樣品分離的直接檢測(cè)方法要求在線(xiàn)電化學(xué)傳感器應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：（1）高選擇性：應(yīng)避免腦透析液中其它神經(jīng)分子，如抗壞血酸、尿酸、多巴胺及其代謝物的干擾; （2）高靈敏度：可有效檢測(cè)腦透析液中的低濃度物質(zhì)，如多巴胺、谷氨酸、乙酰膽堿等; （3）良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性：可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程的流動(dòng)分析; （4）多組分同時(shí)分析：多個(gè)傳感器之間應(yīng)無(wú)交叉干擾; （5）與生理學(xué)研究的兼容性：能夠?qū)崿F(xiàn)在復(fù)雜腦神經(jīng)生理和病理?xiàng)l件下對(duì)于特定神經(jīng)分子的專(zhuān)一性連續(xù)檢測(cè)[52]。

基于氧化酶構(gòu)建的第一代電化學(xué)生物傳感器已被用于構(gòu)建活體在線(xiàn)分析系統(tǒng)。Rogers等[53]通過(guò)電聚合苯酚將葡萄糖氧化酶固定在微流控芯片的工作電極上，有效避免了抗壞血酸、多巴胺等內(nèi)源性電活性分子的干擾。他們結(jié)合快速微透析取樣技術(shù)，研究了SD過(guò)程中腦內(nèi)葡萄糖的變化規(guī)律; 通過(guò)使用地塞米松抗炎藥物，實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)葡萄糖濃度的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)[54]。為了解決H2O2檢測(cè)時(shí)的過(guò)電位問(wèn)題，辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）作為H2O2還原的高效生物酶催化劑，常被用于構(gòu)筑高選擇性的電化學(xué)生物傳感器。在該類(lèi)傳感體系中，通常需要外加電子媒介體實(shí)現(xiàn)HRP和電極之間的電子傳遞。Niwa等[55]制備了固定有谷氨酸氧化酶的反應(yīng)器，將鋨的配合物與HRP復(fù)合而形成的凝膠（Os?gel?HRP）修飾在玻碳電極上，并以此作為檢測(cè)器，發(fā)展了谷氨酸的在線(xiàn)分析方法，靈敏度高（24.3 nA/（μmol/L）），檢出限低（7.2 nmol/L），成功檢測(cè)到KCl刺激單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞及電刺激腦切片引起的亞微摩爾及微摩爾水平的谷氨酸變化。Osborone等[56]制備了一種雙半圓形的工作電極，分別在兩個(gè)半圓電極上修飾了Os?gel?HRP/葡萄糖氧化酶和Os?gel?HRP/乳酸氧化酶，在克服了電極間交叉干擾的前提下，建立了腦內(nèi)葡萄糖和乳酸濃度同時(shí)檢測(cè)的活體在線(xiàn)電化學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)了大鼠在清醒狀態(tài)下大腦紋狀體中葡萄糖和乳酸的連續(xù)監(jiān)測(cè)（圖2）。

Mao等[57]將Os?gel?HRP和次黃嘌呤氧化酶同時(shí)固定在電極上，建立了檢測(cè)次黃嘌呤的在線(xiàn)電化學(xué)分析方法，將檢測(cè)電壓置于200 mV， 避免了抗壞血酸等物質(zhì)的干擾，也提高了檢測(cè)的靈敏度。此外，他們將利用氧化酶構(gòu)建活體在線(xiàn)分析方法的傳統(tǒng)思路拓展，提出利用其它分子作為HRP電子傳遞媒介體發(fā)展活體在線(xiàn)分析方法的新策略[58]，通過(guò)在電極表面電聚合麥爾多拉藍(lán)（Meldola's blue，MB），實(shí)現(xiàn)了HRP與電極之間的界面電子轉(zhuǎn)移，建立了葡萄糖和膽堿測(cè)定的在線(xiàn)電化學(xué)分析方法。

雖然利用HRP可相對(duì)選擇性地測(cè)定H2O2，但易受到內(nèi)源性抗壞血酸的干擾。抗壞血酸干擾H2O2的測(cè)定可通過(guò)以下4個(gè)途徑：（1）抗壞血酸在電極表面的直接電化學(xué)氧化; （2）抗壞血酸在金屬離子（如Fe3+或Cu2+）的催化下與H2O2反應(yīng); （3）HRP催化抗壞血酸與H2O2的化學(xué)反應(yīng); （4）抗壞血酸和HRP的部分媒介體（如Os?gel?HRP）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（圖3B）。針對(duì)此問(wèn)題，Mao等[59]利用環(huán)盤(pán)電極的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在中心的盤(pán)狀電極上修飾抗壞血酸氧化酶，實(shí)現(xiàn)了腦透析液中抗壞血酸的預(yù)氧化; 在環(huán)狀電極上，利用共沉積的方式修飾HRP和媒介體聚吡咯（polypyrrole，PPy），避免了抗壞血酸和媒介體之間的反應(yīng)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了H2O2的選擇性檢測(cè)。此外，他們?cè)贖RP/PPy電極外層再修飾聚苯酚膜（polyphenol，PPh），提高電極的選擇性。在進(jìn)行活體在線(xiàn)分析時(shí)，為了抑制抗壞血酸和H2O2在以金屬離子為催化劑時(shí)可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，他們?cè)谠诰€(xiàn)體系中引入含有EDTA的緩沖溶液，一方面穩(wěn)定了檢測(cè)系統(tǒng)的pH值和氧分壓，另一方面EDTA螯合了金屬離子，進(jìn)而成功地實(shí)現(xiàn)了腦透析液中H2O2的活體在線(xiàn)電化學(xué)分析，如圖3A和3C所示。

針對(duì)“天然酶”HRP不穩(wěn)定性的問(wèn)題，Lin等[60]使用“人工模擬酶”普魯士藍(lán)（PB）代替HRP，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的選擇性傳感， 結(jié)合氧化酶，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖和乳酸的活體在線(xiàn)電化學(xué)分析（圖4）。

Ma等[73]以沸石咪唑酯框架（Zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs）材料為載體，利用其多孔性、高比表面積、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)等特性，實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)催化劑（MG）和葡萄糖脫氫酶的共固定，以及NAD+在復(fù)合層中的快速傳輸?；铙w分析結(jié)果表明，利用ZIFs實(shí)現(xiàn)的MG和葡萄糖脫氫酶的共固定的研究思路，不僅為腦神經(jīng)電化學(xué)分析提供了新策略，也為新型傳感器的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑提供了新途徑[74]。Huang等[75]利用輔酶NAD+在室溫下可與金屬離子Tb3+形成一種無(wú)限配位聚合物（Infinite coordination polymer，ICP）的性質(zhì)，在配位過(guò)程中引入生物識(shí)別單元（葡萄糖脫氫酶）和MG，發(fā)展了“一鍋法”制備同時(shí)包含所有傳感元件（酶、輔酶因子、電催化劑）的納米結(jié)構(gòu)， 該納米結(jié)構(gòu)具有優(yōu)良的生物電化學(xué)活性，可方便地修飾于電極表面。然而，ICP納米顆粒本身不具備導(dǎo)電能力，因此，所制備的電化學(xué)生物傳感器靈敏度較低。針對(duì)此問(wèn)題，Lu等[76]將這種ICP納米顆粒與SWNTs進(jìn)行復(fù)合，制備了均勻分散的ICP/SWNTs復(fù)合物，可通過(guò)簡(jiǎn)單的滴涂法在電極表面形成三維導(dǎo)電網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大大提高傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。該研究不僅為腦神經(jīng)化學(xué)的活體分析提供了新方法，也為脫氫酶電化學(xué)傳感器中傳感元件在電極表面一體化固定提供了新策略。

4?基于漆酶電化學(xué)生物傳感器的活體分析

漆酶是一種藍(lán)銅族氧化酶，可催化酚類(lèi)物質(zhì)的氧化和O2的還原[77]。該酶含有的4個(gè)Cu2+位于蛋白的疏水空腔內(nèi)，其中T1 Cu2+距蛋白表面約0.6 nm，是催化過(guò)程中接收外來(lái)電子的第一站，而由T2和T3 Cu2+形成的三核銅簇是O2的結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)由蛋白內(nèi)電子傳遞途徑接收來(lái)自T1 Cu2+的電子，從而將O2還原成H2O。目前，漆酶已被廣泛應(yīng)用于生物燃料電池、生物傳感、廢水處理等領(lǐng)域。漆酶獨(dú)特的性質(zhì)也為活體分析化學(xué)提供了新途徑。多巴胺是一種兒茶酚胺類(lèi)遞質(zhì)，參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞，在獎(jiǎng)賞、運(yùn)動(dòng)、成癮等過(guò)程中發(fā)揮無(wú)可替代的作用[78]。多巴胺本身具有鄰苯二酚的結(jié)構(gòu)，也是漆酶的底物之一?；诙喟桶吩陔姌O表面發(fā)生電化學(xué)?化學(xué)?電化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理，Xiang等[79]率先提出通過(guò)測(cè)定多巴胺氧化產(chǎn)物5，6?二羥基吲哚啉醌的還原電流，進(jìn)而間接測(cè)定多巴胺的新思想。他們利用漆酶催化多巴胺的第一步氧化反應(yīng)，繼而驅(qū)動(dòng)后續(xù)反應(yīng)的發(fā)生; 其最終產(chǎn)物5，6?二羥基吲哚啉醌具有較好的電化學(xué)活性，在較低電位下可發(fā)生電化學(xué)還原。同時(shí)，抗壞血酸和多巴胺代謝產(chǎn)物3，4?二羥基苯乙酸也可被漆酶催化氧化，生成非電化學(xué)活性的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了在不受抗壞血酸等氧化電流干擾的情況下對(duì)多巴胺的間接測(cè)定。隨后，Lin等[80]合成磁性顆粒，并通過(guò)共價(jià)作用將其表面進(jìn)行漆酶功能化。在磁場(chǎng)作用下，將磁性顆粒填充于石英毛細(xì)管內(nèi)壁，形成磁性漆酶微反應(yīng)器，并將其置于在線(xiàn)電化學(xué)檢測(cè)器上游，從而建立了多巴胺的活體在線(xiàn)分析方法（圖7）。

從基礎(chǔ)生物電化學(xué)的角度，當(dāng)漆酶的疏水腔朝向電極表面時(shí)，T1 Cu2+易與電極之間實(shí)現(xiàn)有效的直接電子轉(zhuǎn)移，但是調(diào)控漆酶在電極表面的朝向一直是生物電化學(xué)研究領(lǐng)域最關(guān)注且富有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題之一[81]。2006年，Zheng等[82]利用碳納米管修飾電極實(shí)現(xiàn)了漆酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，該研究為漆酶直接電化學(xué)的研究提供了新的策略。為了提高生物電化學(xué)催化的電流密度，Wu等[83]通過(guò)在漆酶溶液中加入20%乙醇，有效地提高了漆酶與碳納米管之間的相互作用，使得漆酶在碳納米管上形成了有利于直接電子轉(zhuǎn)移的分子朝向，從而將O2的催化還原電流提高了6倍。隨后，Han等[84]探究了不同碳材料（碳納米管、碳球、石墨烯）用于電極表面固定小漆酶（Small laccase， SLAC）時(shí)對(duì)于O2還原催化效率的差異，發(fā)現(xiàn)SWNTs?SLAC修飾的電極對(duì)于O2還原的催化電流最大?；诖耍麄兲岢隽思{米碳材料表面曲度調(diào)控小漆酶直接電催化行為的模型，為基于納米碳材料的生物電化學(xué)界面設(shè)計(jì)與構(gòu)筑提供了新的方法。

近期，Wu等[85]利用漆酶能在相對(duì)高的電位下催化氧還原特性，使用漆酶修飾的碳纖維電極作為指示陰極，并利用內(nèi)充有弱酸性緩沖液的玻璃毛細(xì)管作為其工作環(huán)境，從而穩(wěn)定指示電極電位; 同時(shí)，以神經(jīng)調(diào)質(zhì)抗壞血酸為檢測(cè)分子，使用碳納米管修飾的碳纖維電極為陽(yáng)極，構(gòu)建了以氧化還原電勢(shì)為信號(hào)讀出方式的電位測(cè)定方法（Galvanic redox potentiometry，GRP），如圖8所示。該原理的提出使得電化學(xué)信號(hào)和電生理信號(hào)的同步記錄成為可能，為研究腦神經(jīng)活動(dòng)中化學(xué)信號(hào)和神經(jīng)電活動(dòng)之間的關(guān)聯(lián)提供了新方法。

5?基于谷氨酸合成酶的生物傳感

除了氧化酶和脫氫酶作為生物識(shí)別元件被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域之外，自然界還存在著種類(lèi)繁多的其它酶類(lèi)，如固氮酶、氫化酶等，它們被應(yīng)用于能源轉(zhuǎn)換、電催化以及電合成等領(lǐng)域。針對(duì)目前基于氧化酶和脫氫酶的電化學(xué)傳感器面臨的一系列問(wèn)題，基于其它酶類(lèi)的活體電化學(xué)生物傳感原理的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑顯得尤為重要。谷氨酸合成酶是固氮過(guò)程中實(shí)現(xiàn)氨同化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，僅存在于微生物和高等植物部分組織中，并參與相應(yīng)的氨基酸代謝和光轉(zhuǎn)換等過(guò)程。目前，谷氨酸合成酶的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，但其在電催化領(lǐng)域的研究尚未被報(bào)道。2018年，Wu等[86]首次將藍(lán)藻細(xì)菌中的鐵氧化還原蛋白和以鐵氧化蛋白為電子供體的谷氨酸合成酶在大腸桿菌體內(nèi)完成重組和表達(dá)。該谷氨酸合成酶主要由氨基轉(zhuǎn)移酶中心、黃素單核苷酸（Flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）和鐵?硫結(jié)合中心組成。他們利用具有不同氧化還原電位的電子傳遞媒介體合理構(gòu)筑電化學(xué)界面，實(shí)現(xiàn)了催化谷氨酸的正向合成和反向氧化兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程，如圖9所示。該酶在催化谷氨酸氧化過(guò)程中不受O2干擾，也無(wú)需外加輔酶，為設(shè)計(jì)谷氨酸檢測(cè)的活體電化學(xué)生物傳感器提供了新思路。

6?基于核酸適配體（Aptamer）的生物傳感

目前，Aptamer已成為診斷和治療的重要分子工具。與天然受體（如抗體和酶）相比，Aptamer作為生物識(shí)別元件，在電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域具有很好的優(yōu)勢(shì)：（1）針對(duì)具體的靶標(biāo)（從小分子到尺寸較大的蛋白質(zhì)甚至細(xì)胞），理論上都可通過(guò)體外篩選的方法，得到具有高特異性和親和力的Aptamer; （2）Aptamer具有化學(xué)穩(wěn)定性; （3）Aptamer在與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)常能發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，該特點(diǎn)可為高靈敏度和高選擇性活體電化學(xué)生物傳感原理的設(shè)計(jì)和構(gòu)筑提供可能[87]。2018年，Nakatsuka等[88]在超薄金屬氧化物場(chǎng)效應(yīng)晶體管陣列上修飾能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)的Aptamer，在生理?xiàng)l件下，實(shí)現(xiàn)了5?羥色胺、多巴胺、葡萄糖、1?磷酸神經(jīng)鞘氨醇的選擇性檢測(cè)，如圖10所示。靶標(biāo)分子和Aptamer結(jié)合誘導(dǎo)后者帶負(fù)電的磷酸二酯骨架發(fā)生構(gòu)象變化，引起柵極調(diào)控半導(dǎo)體通道導(dǎo)電能力的改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了待測(cè)靶標(biāo)的高靈敏檢測(cè)。

基于A(yíng)ptamer的ATP生物傳感器多見(jiàn)報(bào)道，然而，目前廣泛使用的Aptamer亦可與ADP和AMP結(jié)合，對(duì)于A(yíng)TP的識(shí)別專(zhuān)一性較差，因此限制了該類(lèi)傳感器在復(fù)雜體系（如活體）分析中的應(yīng)用。為了提高對(duì)ATP檢測(cè)的選擇性，Yu等[89]報(bào)道了一種具有雙識(shí)別單元的高靈敏、高選擇的ATP傳感器。該傳感器巧妙地結(jié)合了Aptamer對(duì)A堿基的識(shí)別能力和基于咪唑的陽(yáng)離子聚合物Pim對(duì)三磷酸根的強(qiáng)結(jié)合能力，有效提高了對(duì)ATP識(shí)別的專(zhuān)一性，實(shí)現(xiàn)了腦透析液中ATP的高選擇性活體分析。

7?多酶協(xié)同電化學(xué)生物傳感器的活體分析

神經(jīng)系統(tǒng)中存在著一類(lèi)重要化學(xué)物質(zhì)，如乙酰膽堿[90]、ATP[91]、γ?氨基丁酸[92]等，既沒(méi)有電化學(xué)活性，也缺少相對(duì)應(yīng)的氧化酶或脫氫酶識(shí)別元件，利用一般的電化學(xué)生物傳感原理很難實(shí)現(xiàn)其直接檢測(cè)。因此，多酶串聯(lián)反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器應(yīng)運(yùn)而生。如乙酰膽堿的傳感分析可同時(shí)利用乙酰膽堿酯酶（Acetylcholine oxidase， AChE）和膽堿氧化酶（Choline， ChOx），通過(guò)檢測(cè)酶促反應(yīng)過(guò)程中H2O2的生成量實(shí)現(xiàn)乙酰膽堿的傳感分析。但是，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，除抗壞血酸、尿酸等具有電化學(xué)活性的物質(zhì)外，細(xì)胞間液中膽堿的濃度比乙酰膽堿的濃度一般高1000倍左右，這些物質(zhì)都會(huì)干擾乙酰膽堿的測(cè)定。因此，消除膽堿和抗壞血酸的干擾是乙酰膽堿活體分析的關(guān)鍵。Niwa等[93]在微透析取樣?在線(xiàn)電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)研制的過(guò)程中，在乙酰膽堿電化學(xué)傳感器的上游引入固定有膽堿氧化酶和過(guò)氧化氫酶（Catalase）的微柱，先將膽堿及其氧化產(chǎn)生的H2O2消耗掉，從而避免膽堿對(duì)乙酰膽堿的干擾。為了降低抗壞血酸的干擾，他們?cè)贏(yíng)ChE?ChOx/Os?gel?HRP修飾層上修飾了Nafion膜，阻止帶負(fù)電荷的抗壞血酸向電極表面擴(kuò)散?；诖?，他們建立了乙酰膽堿的高選擇在線(xiàn)電化學(xué)分析方法，在大鼠海馬腦切片上，成功檢測(cè)到電刺激誘導(dǎo)的胞外乙酰膽堿濃度的升高。

Burmeister等[94]設(shè)計(jì)了一種多位點(diǎn)的微電極陣列，實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)膽堿和乙酰膽堿的同時(shí)原位測(cè)定。為了排除抗壞血酸和多巴胺的干擾，首先在鉑電極表面電聚合一層間苯二胺膜。兩個(gè)鉑記錄位點(diǎn)只修飾膽堿氧化酶，用于獲取膽堿的濃度信息; 另兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)修飾乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶，其電流信號(hào)與前者的差值即可用于乙酰膽堿的定量分析。

除此之外，針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中部分有相對(duì)應(yīng)氧化酶或脫氫酶識(shí)別元件，但生理濃度較低的神經(jīng)化學(xué)分子（如谷氨酸[95]），為了滿(mǎn)足活體檢測(cè)的需求，該類(lèi)電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì)常采取多酶信號(hào)放大的策略，以實(shí)現(xiàn)底物的循環(huán)，提高檢測(cè)靈敏度。Zhang等[96]利用谷氨酸脫氫酶為識(shí)別元件，谷丙轉(zhuǎn)氨酶實(shí)現(xiàn)谷氨酸的循環(huán)，在進(jìn)行活體在線(xiàn)分析時(shí)，在在線(xiàn)體系中加入丙氨酸啟動(dòng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的酶促反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)谷氨酸測(cè)定信號(hào)的循環(huán)放大，進(jìn)而成功實(shí)現(xiàn)了腦透析液中谷氨酸的活體在線(xiàn)電化學(xué)分析（圖11）。

多酶協(xié)同聯(lián)用的電化學(xué)生物傳感器也被拓展用于腺苷和ATP的活體分析。腺苷是一種能夠調(diào)節(jié)心率、睡眠和呼吸的神經(jīng)調(diào)質(zhì); ATP則是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源，同時(shí)也參與多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Llaudet等[97]在鉑微電極上修飾黃嘌呤氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶和腺苷脫氨酶三種酶，通過(guò)酶促反應(yīng)將腺苷轉(zhuǎn)化為電化學(xué)可檢測(cè)的H2O2。基于這種設(shè)計(jì)模式，他們發(fā)展了一種尺寸小（25～100 μm）、響應(yīng)快（（2±0.23） s）、靈敏度高（100～222 mA/（mol/L cm2））的腺苷電化學(xué)生物傳感器，并將其應(yīng)用于缺氧狀態(tài)下海馬體切片腺苷釋放的活體分析。他們還通過(guò)在鉑微電極表面修飾含有甘油激酶和甘油?3?磷酸氧化酶的薄層，發(fā)展了一種針對(duì)ATP檢測(cè)的多酶型電化學(xué)生物傳感器[98]。該傳感器響應(yīng)時(shí)間短（10%～90%電流響應(yīng)時(shí)間<10 s），靈敏度高（～250 mA/（mol/L cm2））。他們利用該電化學(xué)生物傳感器，首次發(fā)現(xiàn)了ATP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)化學(xué)感應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要作用[99]。

8?總結(jié)與展望

目前，基于電化學(xué)生物傳感器的活體分析已經(jīng)成為分析化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、物理和材料科學(xué)等多學(xué)科交叉研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，對(duì)于推動(dòng)腦神經(jīng)生理和病理分子機(jī)制的研究具有重要意義。本文綜述了多種電極/溶液界面的設(shè)計(jì)策略，旨在建立和發(fā)展可用于活體腦化學(xué)分析的生物電化學(xué)傳感器。然而，在活體層次上準(zhǔn)確地破譯化學(xué)信號(hào)和大腦機(jī)能之間的關(guān)系仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，生命體系的復(fù)雜性，以及分子間相互作用的多樣性，對(duì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的活體測(cè)定提出了更高的要求。創(chuàng)新發(fā)展生物傳感的原理，并研制新型活體可用的傳感器，進(jìn)而開(kāi)展全新的神經(jīng)化學(xué)研究，將是未來(lái)活體生物傳感器研究的核心內(nèi)容之一。首先，隨著電化學(xué)原理和方法的發(fā)展，發(fā)展新的傳感原理，如基于GRP[85]、離子傳輸[100]、有機(jī)電化學(xué)晶體管[101]等原理的電化學(xué)生物傳感器，將為神經(jīng)化學(xué)分析研究提供新的思路。其次，隨著新型材料的不斷涌入，如石墨炔[102]、單原子催化劑[103]、鈣鈦礦[104]等，電化學(xué)生物傳感器的研究將迎來(lái)新的機(jī)遇。另外，具有良好導(dǎo)電性和生物兼容性的柔性材料的出現(xiàn)，將為柔性微型傳感器的設(shè)計(jì)提供可能。利用柔性電極，結(jié)合無(wú)線(xiàn)傳輸技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)清醒動(dòng)物神經(jīng)化學(xué)的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，無(wú)疑將推動(dòng)腦神經(jīng)生理和病理的深入研究和探索; 再次，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，腦科學(xué)的發(fā)展正在邁入新的紀(jì)元，其與各領(lǐng)域的界線(xiàn)逐漸模糊。最后，有效利用新型生物電化學(xué)傳感器探索腦神經(jīng)活動(dòng)的化學(xué)基礎(chǔ)將是人類(lèi)研究腦、認(rèn)識(shí)腦的關(guān)鍵?？傊m然利用電化學(xué)生物傳感器在活體層次精準(zhǔn)獲取化學(xué)信號(hào)研究充滿(mǎn)了挑戰(zhàn)，但相信生物電化學(xué)傳感器在腦神經(jīng)分析化學(xué)研究領(lǐng)域仍具有良好的發(fā)展前景。

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Advances in Electrochemical Biosensors for in Vivo Analysis

WEI Huan1，2， WU Fei1，2， YU Ping1，2， MAO Lan?Qun*1，2

1（Beijing National Laboratory for Molecular Science， Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?As the chemical species build the essential basis for mediating and modulating neurotransmission that determines various physiological and pathological states of the central nervous system （CNS）， the fundamental research on neurochemistry， especially the investigation of the correlation between neurochemical dynamics and activities of vesicles， single cells， neural circuits and the entire brain， has attracted increasing attention due to its significance in understanding the brain function. Electrochemical analytical methods have made tremendous achievements for in vivo and online continuous monitoring of neurotransmitters and neuromodulators. Among them， the methods utilizing enzymes or aptamers as the biorecognition elements and rationally designing electrode surfaces/interfaces to construct the electrochemical biosensors with high selectivity and high sensitivity undoubtedly provide attractive approaches to quantitative monitoring of brain chemistry. This review mainly focuses on the recent advances in electrochemical biosensors for in vivo analysis.

Keywords?Electrochemical biosensors; In vivo analysis; Online electrochemical analysis; Brain chemistry; Review