原曉龍，李 娟,2，李云琴，王 毅

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204；2.云南大學(xué) 中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650091）

球孢白僵菌Beauveria bassiana是一種可寄生在多種昆蟲上具較強(qiáng)致病性的真菌，已被廣泛用作防治森林、農(nóng)作物蟲害的生物農(nóng)藥［1-2］；它產(chǎn)生大量如非核糖體多肽、聚酮類等次生代謝產(chǎn)物，可抑制多種腐生或寄生線蟲［3-4］。聚酮、非核糖體多肽及其雜合化合物如聚酮中的紅霉素［5］、四環(huán)素［6］；非核糖體多肽中的青霉素、頭孢霉素［7-8］；聚酮和非核糖體多肽的雜合化合物如他克莫司［9］、雷帕霉素［10］、博來霉素［11］、埃博霉素［12］等具有免疫抑制劑或抗腫瘤等生理活性［13］。迄今為止，球孢白僵菌中的聚酮和非核糖體多肽雜合型化合物僅有卵孢白僵菌素經(jīng)基因敲除和異源表達(dá)鑒定的報道［3］。聚酮類和非核糖體肽是2類典型的小分子天然次生代謝化合物，分別由聚酮合酶（polyketide synthases,PKS）、非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）催化簡單單體脂肪酸或氨基酸縮合形成［13-14］。真菌聚酮合酶主要屬于Ⅰ型PKS［13,15］， 其結(jié)構(gòu)域通常包括酮體合成酶（ketosynthase,KS）， 酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase,AT），脫水酶（dehydratase,DH），甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase,MT），烯酯酰還原酶（enoylreductase,ER）， 酮體還原酶（ketoreductase,KR），?；d體蛋白（acyl carier pretein,ACP）和末端釋放酶等［13］，短鏈醇脫氫酶（short chain dehydrogenase/reductase，SDR）家族在PKS中屬末端釋放酶［16］，PKS中的SDR結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镞x擇具一定的特異性［17］；NRPS是一種由多模塊組成的多酶復(fù)合體，由腺苷酰化結(jié)構(gòu)域（adenylation domain,A），肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域（phosphopantetheine attachment site,PP）和縮合結(jié)構(gòu)域（condensation domain,C）等3個核心結(jié)構(gòu)域按照特定的時空順序排列組成［18］。真菌PKS/NRPS酶蛋白復(fù)合物含有N端的PKS組件和C端的NRPS組件［19］，可催化生成含有?；桶滨；鶚?gòu)件的聚酮和氨基酸或肽類型化合物的生物合成［9,20］；同時聚酮和氨基酸或肽類化合物能夠通過它們化學(xué)屬性的混合，擴(kuò)展其產(chǎn)物的生物活性，埃博霉素（epothilone）、雷帕霉素（rapamycin）和博來霉素（bleomycin）是這類混合分子中重要代表，編碼這些化合物的PKS/NRPS基因大小均約10 kb［21］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，真菌基因組數(shù)據(jù)不斷增加，基因組數(shù)據(jù)顯示目前已通過結(jié)構(gòu)鑒定、表型篩選和生物活性測定等傳統(tǒng)方法分離的天然次生代謝產(chǎn)物僅為冰山一角，真菌基因組中尚有大量的天然次生代謝產(chǎn)物生物合成基因存在；該類基因大多數(shù)條件下處于沉默狀態(tài)，其參與合成的化合物大多尚未被鑒定［22］；應(yīng)用基因組挖掘技術(shù)可將這些沉默的生物合成基因分離出來，再通過改變培養(yǎng)基配方和條件或進(jìn)行遺傳學(xué)修飾等方式誘導(dǎo)以激發(fā)它們?nèi)康拇紊x潛力［23-24］。為了發(fā)掘球孢白僵菌中聚酮和非核糖體多肽雜合類化合物的生物合成基因，本研究采用基因組挖掘的方式從其基因組數(shù)據(jù)中獲得1條PKS/NRPS基因（命名Bbpks2），通過生物信息學(xué)分析預(yù)測其潛在功能，嘗試尋找該基因的表達(dá)條件，為最終確定其天然產(chǎn)物及對其異源表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

昆蟲致病真菌球孢白僵菌（菌株號：YH02）來源于云南云百草生物技術(shù)有限公司，將YH02菌株接種在MY固體培養(yǎng)基（malt/yeast extract medium）上，置于25℃恒溫條件下培養(yǎng)，每隔2周轉(zhuǎn)接1次；用于基因組DNA和總RNA提取的真菌接種于液體MY培養(yǎng)基中，置于120 r·min-1和25℃條件下培養(yǎng)5～7 d后，收獲約0.5 g菌絲體，用吸水紙徹底吸干后在液氮環(huán)境下用研缽研磨成粉末用于基因組DNA和總RNA的提取。MY培養(yǎng)基的具體配方麥芽糖6.0 g·L-1，酵母提取物4.0 g·L-1，固體培養(yǎng)基配置時加20.0 g·L-1瓊脂。

1.2 試劑與器材

試驗(yàn)涉及試劑包括：真菌基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），高保真聚合酶、真菌總RNA提取試劑盒（大連寶生物工程公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），無縫克隆試劑盒（Biomiga）。主要使用儀器為NanoDropTM2000紫外分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）、Azure C300凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、多功能組合搖床（江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.3 Bbpks2基因的挖掘及克隆

首先以曲霉中已報道過的PKS基因?yàn)槟０澹帽镜谺LAST（basic local alignment search tool）對球孢白僵菌基因組進(jìn)行掃描，獲得可能含有PKS基因的重疊群（contigs），然后利用antiSMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org/）軟件進(jìn)行驗(yàn)證，并利用GENEFISH對重疊群進(jìn)行開放閱讀框掃描，通過生物信息學(xué)分析獲得白僵菌基因組中Bbpks2基因的DNA序列。

根據(jù) DNA 序列設(shè)計 2對特異引物（Bbpks25F： 5′-ATGTCTTCGCACCAAAACGA-3′；Bbpks2MR： 5′-AACAGCACTGTCACTGTCCAC-3′；Bbpks2MF： 5′-AACGCTGGCTATAATGCTCTT-3′；Bbpks23R： 5′-GGCTTCCTGGAGCGGTAA-3′）用于Bbpks2基因全長cDNA的克隆。以球孢白僵菌的cDNA為模板，用HiFi高保真酶分別擴(kuò)增出Bbpks2基因的5′片段和3′片段，經(jīng)DNA純化試劑盒將這2個片段純化后，按照無縫克隆試劑盒說明書中的具體步驟將Bbpks2基因的5′片段和3′片段連接起來，獲取全長cDNA。將該基因片段連接到克隆載體Peasy-T3上，轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，通過菌落PCR篩選含有插入片段的陽性克隆送到上海生工進(jìn)行測序。

1.4 聚類分析方法

從美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）上選擇功能已知且鑒定過化合物的PKS/NRPS蛋白序列，包括黃曲霉Aspergillus flavus，米曲霉A.oryzae中編碼環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid）生物合成的CpaA基因（BAI43678，BAG82673），擴(kuò)展青霉Penicillium expansum中編碼球毛殼甲素（chetoglobosin A）生物合成的CheA基因（CAO91861），棒曲霉A.clavatus中編碼細(xì)胞松弛素E（cytochalasin E）生物合成的CcsA基因XM_001270542，異孢鐮刀菌Fusarium heterosporum中編碼伊快霉素（equisetin）的EqiS基因（Q5SBL2），水稻惡苗病菌Fusarium fujikuroi，串珠赤霉菌Gibberella moniliformis及假禾谷鐮孢菌Fusarium pseudograminearum等真菌中編碼鐮刀菌素 C（fusarin C）生物合成的FusA（AFP73394），F(xiàn)usS（AAT28740），pks10（EKJ71911）等基因，煙曲霉Aspergillus fumigatus中編碼假散囊菌素A（pseurotin A）的PsoA基因（ABS87601），球孢白僵菌中編碼卵孢白僵菌素（tenellin）的TenS基因（XP_008600657）等蛋白序列用于聚類分析，采用MEGA 7.0中的Clustal W程序?qū)λx擇的PKS蛋白序列和球孢白僵菌中的BbPKS1蛋白序列進(jìn)行比對后，采用鄰位相接法（neighbor-joining），自檢舉1000次，其余采用默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。依據(jù)聚類結(jié)果，從基因起源與功能分化的角度預(yù)測該基因功能，并進(jìn)一步推測該基因產(chǎn)生的聚酮化合物。

1.5 Bbpks2基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)

根據(jù)分離得到的Bbpks2基因的DNA序列，設(shè)計特異檢測引物（TBbpks2F：TCTCCTTGGCAAGGTTACTG；TBbpks2R：ACCACGCTCCATCATGTACT）。然后將球孢白僵菌培養(yǎng)在添加不同碳源、氮源的培養(yǎng)基上。不同碳源實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為6.0 g·L-1麥芽浸粉，3.0 g·L-1酵母提取物，分別添加4.0 g·L-1乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、果糖、肌醇；不同氮源實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1.8 g·L-1麥芽糖，6.0 g·L-1葡萄糖，分別添加4.0 g·L-1牛肉浸粉、酪蛋白胨、胰蛋白胨、馬鈴薯。培養(yǎng)14 d后，從每種培養(yǎng)基上收獲0.5 g菌絲體，采用真菌總RNA提取試劑盒按照說明書步驟提取各自的總RNA，并選擇濃度合適的RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用特異引物TBbpks2F和TBbpks2R檢測該基因的表達(dá)情況。

在瓊脂糖凝膠電泳檢測過程中，各PCR產(chǎn)物和1 kb DNA marker的點(diǎn)樣量均為2.5 μL，電泳結(jié)束后，利用Azure C300凝膠成像系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件分析各條帶的積分光密度，比較各PCR產(chǎn)物條帶的積分光密度值，并以該值與1 kb marker的條帶進(jìn)行比較作為相對表達(dá)量繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bbpks2基因全長cDNA的克隆及其序列分析

經(jīng)無縫克隆獲得Bbpks2基因的全長cDNA。分析顯示：Bbpks2基因全長12051 bp，編碼4016個氨基酸；經(jīng)過序列相似性及保守結(jié)構(gòu)域的分析顯示，該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域組織順序?yàn)镵S-AT-DHMT-KR-ACP-C-A-PP-SDR；該蛋白同時含有PKS和NRPS酶蛋白的結(jié)構(gòu)域，由此推斷該蛋白是一種PKS/NRPS酶蛋白復(fù)合體。

2.2 BbPKS2蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

球孢白僵菌中BbPKS2蛋白與其他真菌PKS/NRPS蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖1），該聚類樹可分為4個較大的亞類（分支Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ），各個亞類間的結(jié)構(gòu)域組織順序存在差異，至少存在1個結(jié)構(gòu)域的不同；鐮刀菌屬Fusarium真菌中編碼伊快霉素、不同真菌中參與編碼細(xì)胞松弛素E的酶蛋白聚到同一分支上，且二者親緣關(guān)系明顯較近。球孢白僵菌的BbPKS2蛋白與這2類酶蛋白被歸類到分支Ⅱ中，該亞類的結(jié)構(gòu)域組織順序?yàn)镵S-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR；BbPKS2與球孢白僵菌JEF007菌株（PMB64475.1）、頭狀蟲草Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）聚在一個亞分支中； 推測BbPKS2蛋白所參與合成的天然次生代謝產(chǎn)物與伊快霉素、細(xì)胞松弛素E存在一定的結(jié)構(gòu)相似性。

圖1 球孢白僵菌中BbPKS2蛋白與其他真菌中雜合PKS/NRPS蛋白的聚類分析Figure 1 Phylogenetic analysis of the protein BbPKS2 of B.bassiana and other relative fungal hybrid PKS/NRPS proteins

2.3 Bbpks2基因在含有不同碳氮源添加物培養(yǎng)基上的表達(dá)

在含有不同碳氮源添加物的培養(yǎng)基上，Bbpks2基因表達(dá)差異極其顯著。當(dāng)添加不同碳源添加物時（圖2），在乳糖培養(yǎng)基上，Bbpks2基因的表達(dá)量最高，其表達(dá)量顯著高于其他培養(yǎng)基；而在麥芽糖培養(yǎng)基上，Bbpks2基因不表達(dá)；Bbpks2基因表達(dá)量從高到低依次為乳糖，葡萄糖，山梨醇，肌醇，甘露糖，果糖，其中以乳糖為碳源添加物的培養(yǎng)基上其表達(dá)量最低至少為其他添加物的3.4倍以上。當(dāng)添加不同氮源添加物時（圖3），Bbpks2基因均有明顯表達(dá)，在含牛肉浸粉培養(yǎng)基上，Bbpks2基因的表達(dá)量最高，其表達(dá)量最低為其他的1.3倍以上；而在含酪蛋白胨的培養(yǎng)基上，該基因表達(dá)量最低?？梢娫摶蚴芴荚粗腥樘?、氮源中牛肉浸粉的影響較大；而受到碳源中麥芽糖、氮源中酪蛋白胨的影響則可以忽略。

圖2 Bbpks2基因在含有不同碳源培養(yǎng)基上的表達(dá)Figure 2 Expression level of Bbpks2 gene in the medium containing different carbon additives

圖3 Bbpks2基因在含有不同氮源添加物培養(yǎng)基上的表達(dá)Figure 3 Expression level of Bbpks2 gene in the medium containing different nitrogen additives

3 討論

球孢白僵菌主要是在機(jī)械壓力和酶共同作用下侵染昆蟲寄主［25］，在昆蟲體內(nèi)通過次生代謝途徑中相關(guān)酶類所產(chǎn)生的毒素致死寄主［1］。但該真菌次生代謝途徑中所產(chǎn)生的毒素除少數(shù)外，尚有大量的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因未與相關(guān)化合物關(guān)聯(lián)。結(jié)合基因組挖掘技術(shù)和一菌多產(chǎn)物策略（one strain many compounds，OSMAC）、異源表達(dá)等操作技術(shù)可促進(jìn)該問題的解決，從真菌基因組數(shù)據(jù)中可大量挖掘得到PKS，NRPS等生物合成基因，通過序列相似性、結(jié)構(gòu)域、基因片段的大小及聚類分析等初步推斷該基因的功能，初步了解該酶所參與合成化合物的某些結(jié)構(gòu)［15，26］。如編碼2-吡啶酮卵孢白僵菌素（2-pyridone tenellin）酶蛋白的PKS/NRPS基因約12.9 kb［27］，編碼鐮刀菌素C酶蛋白的fusA基因（PKS/NRPS）約11.9 kb［28］；BALI等［17］在大腸埃希菌Escherichia coli中過量表達(dá)其SDR等末端釋放結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物具較高活性。同時因本研究中的Bbpks2基因尚未發(fā)現(xiàn)有較高同源性基因存在，通過結(jié)構(gòu)域分析推測該基因所編碼的酶蛋白屬于PKS/NRPS，參與聚酮/非核糖體多肽的生物合成，且該化合物與伊快霉素、細(xì)胞松弛素E存在某些共同的結(jié)構(gòu)；通過比較分析伊快霉素、細(xì)胞松弛素E，綜合分析該化合物可能含吡咯烷酮結(jié)構(gòu)。

基因挖掘技術(shù)為迅速發(fā)現(xiàn)隱藏在基因組中的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因和新生物合成機(jī)制提供了一種強(qiáng)力有效的方法。挖掘獲得聚酮、非核糖體多肽等天然次生代謝產(chǎn)物的生物合成基因后，通過系統(tǒng)變換培養(yǎng)條件，如通過改變培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式、滲透壓及一菌多產(chǎn)物（OSMAC）等方式可選擇性地上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)激發(fā)它們?nèi)康漠a(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的潛力，將基因組中沉默的PKS和NRPS等基因誘導(dǎo)表達(dá)出來［22-23］。本研究通過分析Bbpks2基因在含不同碳氮源添加物培養(yǎng)基上的具體表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在以乳糖為碳源、以牛肉浸粉為氮源的培養(yǎng)基上能夠獲得較大量的表達(dá)；在含有不同培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基上，該基因的表達(dá)情況差異顯著；在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上，該基因不表達(dá)，在以酪蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，該基因表達(dá)量顯著低于在以牛肉浸粉、馬鈴薯浸粉和胰蛋白胨等作為氮源的培養(yǎng)基的表達(dá)量。這種同一基因在含不同成分培養(yǎng)基上出現(xiàn)表達(dá)差異的現(xiàn)象存在于許多真菌中，如長松蘿Usnea longissima中UsNRPS基因可被蔗糖和果糖強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而被天冬氨酸抑制［29］；通過OSMAC策略從鄔氏黃絲曲霉Talaromyces wortmannii中獲得3種新型的聚酮［23］；從三線鐮刀菌Fusarium tricinctum在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選獲得了2個新型的聚酮：fusarielin K和fusarielin L［30］。這種基因在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)研究有助于找出不同次生代謝基因的最適表達(dá)培養(yǎng)基類型，對通過真菌菌絲體獲得新穎的次生代謝化合物，及將相應(yīng)化合物和具體基因關(guān)聯(lián)起來具有指導(dǎo)意義。

本研究通過基因組挖掘技術(shù)從球孢白僵菌基因組中發(fā)掘得到了一個PKS/NRPS基因Bbpks2，克隆得到其全長cDNA，用聚類分析的方式對其終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并通過添加不同碳源和氮源篩選能夠誘導(dǎo)該基因表達(dá)的最佳培養(yǎng)基條件，為球孢白僵菌中PKS/NRPS基因的異源表達(dá)及基因功能鑒定，發(fā)掘新穎或具潛在生物活性的聚酮和非核糖體多肽雜合化合物奠定了前期基礎(chǔ)。