楊玉春，王 莉，楊艷敏，孫 斌，田 穎，劉 成*

（1 遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧 熊岳115009；2 遼寧省凌海市果蠶管理局，遼寧 凌海121200）

藍(lán)莓的組織培養(yǎng)研究最早始于1976年，Hall在矮叢藍(lán)莓上進(jìn)行莖段培養(yǎng)[1]。隨后Sharon G.Billings，Rowland等又進(jìn)行了藍(lán)莓的離體葉片再生研究。離體葉片再生是指利用離體葉片，在適宜培養(yǎng)基、激素種類及其濃度的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，得到完整植株的技術(shù)[2，3]。藍(lán)莓作為一種新興的小漿果近年來得到迅猛發(fā)展，建立完整的葉片再生體系可以有效保存藍(lán)莓的種質(zhì)資源、加速品種選育和資源更新。離體葉片再生技術(shù)研究的主要內(nèi)容集中在培養(yǎng)基類型、激素種類及其濃度、暗培養(yǎng)時(shí)間等方面。藍(lán)莓的離體葉片再生受到內(nèi)因和外因兩方面限制。內(nèi)因即基因型，是藍(lán)莓離體葉片再生的主要限制因子；外因是指激素種類及其濃度、溫度、pH 值、培養(yǎng)基類型、暗培養(yǎng)時(shí)間等因素。本試驗(yàn)以兩個(gè)藍(lán)莓品種即北高叢藍(lán)莓‘斯巴坦’和半高叢藍(lán)莓‘北陸’為試材，系統(tǒng)研究培養(yǎng)基中不同激素種類及其濃度配比、不同pH 值、葉片處理方式及暗培養(yǎng)對(duì)離體葉片再生的影響。擬初步建立‘斯巴坦’和‘北陸’的葉片再生體系，以期為藍(lán)莓的快速、高效、規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

供試品種如前述。試驗(yàn)在遼寧省果樹科學(xué)研究所小漿果研究室組織培養(yǎng)室中進(jìn)行，配制好的培養(yǎng)基經(jīng)120 ℃高壓滅菌20 min后自然冷卻備用。在溫度 （24±2）℃、相對(duì)濕度80%、光周期12 h、暗期12 h，光強(qiáng)2 000 lx的條件下培養(yǎng)。每處理接種60片葉，3次重復(fù)。試驗(yàn)材料均為無菌組培苗，全部由遼寧省果樹科學(xué)研究所小漿果研究室提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基選擇

2.1.1 最佳培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)

以WPM 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加糖30 g/L。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加不同濃度ZT、IAA 進(jìn)行匹配，每處理5 次重復(fù)（表1）。8 周后調(diào)查葉片再生率，以再生率最高的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

表1 再生培養(yǎng)基不同激素濃度配比

2.1.2 最適pH 值和瓊脂濃度選擇試驗(yàn)

以培養(yǎng)基A5 為基礎(chǔ)，pH 值設(shè)4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 ，共6 個(gè)梯度，再依次搭配不同濃度瓊脂（表2）。將藍(lán)莓組培苗離體葉片接種到培養(yǎng)基上，每處理10次重復(fù)。每周記錄不同處理各品種葉片的再生率、再生時(shí)間、愈傷組織大小、葉色及長勢，選擇最佳培養(yǎng)基pH值。

表2 不同pH 值培養(yǎng)基的瓊脂量 g

2.2 葉片創(chuàng)傷和放置方式試驗(yàn)

采用A5 培養(yǎng)基，pH 值調(diào)到4.5，選擇長勢一致、大小相近的葉片，以酒精燃燒消毒的剪刀剪去葉片一部分。設(shè)葉面向上、葉背向上兩種擺放形式；創(chuàng)傷形式設(shè)葉柄端、葉尖端、葉兩端各剪去1/3，共3 個(gè)處理，每處理10 次重復(fù)。接種后8 周調(diào)查不同葉片處理方式的再生時(shí)間、再生率。選擇最佳葉片放置方式。

2.3 暗培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)

接種后放入暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，設(shè)0、7、14、21 d，共4 個(gè)處理，每處理5 次重復(fù)。培養(yǎng)8 周后調(diào)查再生時(shí)間和再生率，擬選擇最佳暗培養(yǎng)時(shí)間。

3 結(jié)果與分析

3.1 激素種類及其濃度組合對(duì)葉片再生率的影響

由表3可以看出，在培養(yǎng)基A5（WPM+ ZT 1.5 mg/L+IAA 0.3 mg/L）上，‘北陸’‘斯巴坦’兩個(gè)藍(lán)莓品種葉片再生效果最佳，‘北陸’葉片再生率達(dá)93.5%，‘斯巴坦’再生率達(dá)到89.8%，‘北陸’再生效果優(yōu)于‘斯巴坦’；在培養(yǎng)基A9（WPM+ ZT 2.0 mg/L +IAA 0.4 mg/L）上，兩個(gè)品種葉片再生效果均最差，也是‘北陸’再生效果優(yōu)于‘斯巴坦’。這可能與品種的基因型有關(guān)，‘北陸’在生產(chǎn)應(yīng)用中較‘斯巴坦’適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)，有更廣泛的栽培區(qū)域。

表3 不同激素濃度培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓試管苗生長發(fā)育的影響 %

3.2 pH 值和瓊脂濃度對(duì)葉片再生的影響

隨著pH 值的升高，不同品種葉片在同一pH 值下及同一品種的葉片在不同pH 值下的葉色、愈傷組織、再生芽數(shù)等均不同，再生時(shí)間為發(fā)現(xiàn)肉眼可見再生芽的平均記錄時(shí)間。

由表4可以看出，‘北陸’ 在不同pH 值條件下，生長情況不同，pH 值為5.0 時(shí)株高、新生芽數(shù)均顯著優(yōu)于其他處理，再生率最高（96.5%），再生時(shí)間短(37.7 d)，葉色綠；其次為pH 值為4.5 的；再次為pH 值為4.0 的。效果最差的為pH 值6.5，pH 值5.5 和6.0 的也不好。說明藍(lán)莓適宜酸性環(huán)境?！标憽钸m宜的培養(yǎng)基pH 值為5.0。同理，‘斯巴坦’培養(yǎng)基的最適pH 值為4.5?？梢姡囵B(yǎng)基pH 值是影響藍(lán)莓葉片再生效果的關(guān)鍵因素，適宜的培養(yǎng)基pH 值可以增加葉片再生率。A5 培養(yǎng)基制好后的原始pH 值為5.2，可以直接用作‘北陸’的葉片再生培養(yǎng)基；用在‘斯巴坦’上則需要用酸調(diào)節(jié)pH 值到4.5，否則影響再生效果。

兩個(gè)品種的適宜瓊脂濃度分別為5.0 g/L和6.5 g/L。

表4 培養(yǎng)基中不同pH 值為對(duì)藍(lán)莓離體葉片再生的影響

3.3 不同葉片處理對(duì)再生的影響

由表5可知，各葉片創(chuàng)傷處理形式對(duì)藍(lán)莓葉片再生影響不大，在進(jìn)行藍(lán)莓葉片再生時(shí)，可以任意對(duì)藍(lán)莓葉片進(jìn)行創(chuàng)傷，且不限葉片擺放形式。葉兩端創(chuàng)傷產(chǎn)生的愈傷組織較多，再生植株也較多，后期生長養(yǎng)分供應(yīng)不足，植株黃化早、明顯；生根培養(yǎng)時(shí)因?yàn)樵偕仓甓唷⒕o密，分株相對(duì)比較困難。葉尖端創(chuàng)傷方式容易從葉柄處形成愈傷組織并產(chǎn)生再生植株，而并非葉片離體再生。

表5 不同葉片處理方式對(duì)藍(lán)莓葉片再生的影響

3.4 暗培養(yǎng)對(duì)葉片再生的影響

由表6可知，各暗處理時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉片再生影響不大，在藍(lán)莓葉片再生試驗(yàn)過程中可以不進(jìn)行暗培養(yǎng)。

表6 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉片再生的影響

4 討論

本文以北高叢藍(lán)莓品種‘斯巴坦’和半高叢藍(lán)莓品種‘北陸’的試管苗葉片為外植體，通過對(duì)培養(yǎng)基中不同激素種類及其濃度配比、不同pH 值、葉片處理方式及暗培養(yǎng)對(duì)離體葉片再生影響進(jìn)行研究，建立了北高叢藍(lán)莓‘斯巴坦’和半高叢藍(lán)莓‘北陸’植株葉片再生體系，為進(jìn)一步工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

在基本培養(yǎng)基方面，根據(jù)馬懷宇等[4]對(duì)高叢藍(lán)莓離體葉片再生研究，本試驗(yàn)選擇最適合高叢藍(lán)莓葉片再生的WPM 培養(yǎng)基。在激素及其配比方面，本研究結(jié)果表明，1.5 mg/L ZT +0.3 mg/L IAA 誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳，其中‘北陸’再生率達(dá)到最高93.5%而‘斯巴坦’再生率達(dá)到最高89.8%。這與馬懷宇等[4]在高叢藍(lán)莓離體葉片再生研究結(jié)果比較一致。培養(yǎng)基pH 值的研究結(jié)果表明，最適合‘斯巴坦’葉片再生的培養(yǎng)基pH 值為4.5，最適合‘北陸’葉片再生的pH 值為5.0。當(dāng)pH 值過高或過低時(shí)，再生率降低，愈傷組織形成的少或無，葉片發(fā)黃或最后枯萎。本研究在葉片放置方式和暗培養(yǎng)方面對(duì)兩個(gè)品種藍(lán)莓離體葉片再生影響不大，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)果不同[5,6]，還有待于進(jìn)一步研究。