閔 紅，楊 靜，呼延婷婷，繩金房

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

水分活度（aw）指樣品中水分的飽和蒸氣壓與相同溫度下純水的飽和蒸氣壓的比值[1]。樣品中的水可分為結(jié)合水和自由水兩類，只有自由水能被微生物生長、繁殖、孢子萌發(fā)所利用。aw反映產(chǎn)品中微生物新陳代謝的可利用水（結(jié)合水）的量度，其值介于0～1[2]。目前，aw常用的3種方法為露點／冷面鏡法、電子濕度計法和相對平衡濕度法。其中，露點／冷面鏡法具有精確度高（±0.003）、檢測速度快（＜ 5 min）、檢測范圍廣（0.03 ～ 1.00）、準確度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[3-4]，是美國藥典41版（USP 41）、歐洲藥典第九版（EP 9.0）、日本藥局方 2016年版（JP 2016）、美國分析化學家協(xié)會（AOAC）、國際標準化組織（ISO）等機構(gòu)推薦使用的aw測定方法。2015年版《中國藥典》尚未收載此內(nèi)容，這與我國藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）強調(diào)的藥品微生物質(zhì)量源頭設(shè)計（QbD）和過程控制的理念不相適應(yīng)。本研究中將藥品分別置aw為 0.328，0.529，0.753，0.902，0.973 的密閉環(huán)境中，對藥品aw和載荷微生物的生長規(guī)律進行研究，揭示將樣品儲存于不同aw環(huán)境下的水分遷移規(guī)律及樣品載荷微生物變化規(guī)律。本研究內(nèi)容填補了國內(nèi)藥品aw研究的空白，為制訂《中國藥典》“非無菌制劑水分活度測定的應(yīng)用指導原則”奠定了理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（天津鑫博得儀器有限公司）；LRH-250F型生化霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；Aqualab型水分活度儀（美國Decagon公司）。

菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白 色 念 珠 菌 （Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

試藥：婦康片（陜西東泰制藥有限公司，批號為8E01，規(guī)格為每片0.5g）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物限度方法適用性試驗

為了模擬藥品微生物的自然污染狀態(tài)，將藥品置于非潔凈區(qū)環(huán)境進行生產(chǎn)，造成環(huán)境中細菌、霉菌和酵母菌對該藥品的污染。稱取樣品10 g，分別加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，200 mL，45℃水浴15 min，振搖使其分散均勻，制成1∶10和1∶20供試液。計數(shù)方法適用性試驗分試驗組、供試品對照組和菌液對照組，進行3次平行試驗。

1）試驗組取1∶10供試液分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，再分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液各0.1 mL，混勻，得樣品液。

2）供試品對照組取供試液原液9.9 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基0.1 mL，混勻，得樣品液。

3）菌液對照組取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗組操作，分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液各 0.1 mL，混勻，得樣品液。

取制備好的試驗組樣品液1 mL，置直徑為90 mm的無菌平皿中，注入溫度不超過45℃熔化的培養(yǎng)基約20 mL，其中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌注入TSA，白色念珠菌和黑曲霉注入SDA，混勻，凝固，按規(guī)定條件倒置培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌落數(shù)，觀察各組的平均菌落數(shù)，計算各試驗菌回收率。各試驗菌回收率=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)。各試驗菌回收率不得低于50%，否則需繼續(xù)進行方法適用性試驗，直至消除供試品的抑菌性。

1.2.2 不同環(huán)境aw的制備

將不同質(zhì)量氯化鈉加入500 mL純化水中，分別制成 aw為 0.328，0.529，0.753，0.902，0.973 的氯化鈉溶液，分別加入相應(yīng)干燥器中，制備 aw分別為 0.328，0.529，0.753，0.902，0.973 的儲存環(huán)境。

1.2.3 aw、需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)測定

準確稱取10 g藥品置小平皿內(nèi)，共稱取36份，將其放入aw為0.328的干燥器中，同法分別將樣品置aw為 0.529，0.753，0.902，0.973 的干燥器中，在 25 ℃條件下密閉儲存3個月，從0周開始，每周對樣品aw、需氧菌總數(shù)（TAMC）、霉菌與酵母菌總數(shù)（TYMC）進行檢測。TAMC和TYMC檢測方法為2.1項下微生物限度方法適用性試驗得出的檢測方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計與分析，揭示將樣品在不同aw環(huán)境下儲存水分的遷移規(guī)律及載荷微生物變化規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 TAMC及TYMC適用性試驗

取1∶10供試液制得的樣品液各1 mL傾注平皿，按“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查項下計數(shù)檢查法（通則1105）”檢查，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉回收比值在0.5～2.0之間，金黃色葡萄球菌回收比值不足0.5，不可?。划斎?∶20供試液制得的樣品液各1 mL傾注平皿，金黃色葡萄球菌的回收比值為0.8，0.9，0.8，可取。結(jié)果見表 1。然后在平皿中加入TSA，搖勻，待凝固后置 35℃條件下培養(yǎng) 5 d進行TAMC計數(shù)。

表1 TAMC方法適用性試驗各試驗菌回收比值

取1∶10供試液制得的樣品液1 mL傾注平皿，按照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查計數(shù)檢查法（通則1105）”檢查，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌和黑曲霉試驗菌的回收比值均在 0.5～2.0之間，可取。結(jié)果見表 2。然后在平皿中加入SDA，搖勻，待凝固后置25℃條件下培養(yǎng)7 d進行該TYMC計數(shù)。

表2 TYMC適用性試驗各試驗菌回收比值（n=3）

2.2 aw的遷移規(guī)律

藥品aw隨時間變化的曲線見圖1 A?？梢姡幤穬Υ嬗?5 種不同 aw（0.328，0.529，0.753，0.902，0.973）環(huán)境，樣品aw在第1周表現(xiàn)出急劇增加，隨后緩慢增加，并逐漸與環(huán)境aw趨于一致。

當 環(huán) 境 aw分 別 為 0.328，0.529，0.753，0.902，0.973時，藥品儲存1周的 aw較初始值分別增加了9.34% ，62.63% ，111.49% ，149.22% ，160.28% 。樣品儲存1周后的aw隨時間的延長緩慢增加，并逐漸與環(huán)境aw保持一致，當環(huán)境aw為0.328時，藥品aw在第1周就達到0.347，1周后隨著儲存時間的延長，藥品aw無顯著性變化；當環(huán)境 aw為0.529時，藥品aw在第2周達到0.538，2周后隨著儲存時間的延長，藥品aw無顯著變化；當環(huán)境aw為0.753時，藥品儲存12周的aw為0.755；當環(huán)境 aw為 0.902 和 0.973 時，藥品儲存 12 周的aw分別為0.901和0.954，藥品aw需要更長的儲存時間才能與環(huán)境aw保持一致。表明藥品aw低于其儲存環(huán)境aw時的水分遷移規(guī)律，即藥品aw最終與其儲存環(huán)境aw保持一致，環(huán)境aw越大，藥品達到環(huán)境aw所需時間越長。

2.3 TAMC及TYMC變化規(guī)律

將樣品置低 aw環(huán)境時（aw為 0.328 和 0.529），樣品TAMC和TYMC隨時間的延長有降低趨勢。當環(huán)境aw為 0.328時，樣品 TAMC 數(shù)量在第 10，11，12周分別較初始值降低 6.57%，5.36%，10.51%；樣品 TYMC 數(shù)量在第 8，9，10，11，12 周分別較初始值降低 2.75% ，8.01% ，14.79% ，14.79% ，9.95% ；當 aw為 0.529 時，樣品 TAMC 在第 8，9，10，11，12 周分別較初始值降低4.62%，2.94% ，15.29% ，4.26% ，13.75% ，樣品 TYMC在第 7，8，9，10，11，12 周分別較初始值降低 9.95% ，11.03% ，17.89% ，4.76% ，9.95%，4.76%。將樣品置較高 aw環(huán)境時（aw為 0.753，0.902，0.973），樣品 TAMC和TYMC隨時間的延長呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，樣品TAMC和TYMC無顯著變化。分析原因為，藥品置較高aw環(huán)境時（aw為 0.753，0.902，0.973），該環(huán)境 aw能達到微生物生長條件，但婦康片的成分為益母草、延胡索（醋制）、阿膠、當歸、人參、熟地黃、白芍（酒制）、川芎、白術(shù)（炒）、茯苓、炙甘草，不能提供微生物生長所需要的氮源、碳源、無機鹽、生長因子等營養(yǎng)成分，故在環(huán)境aw較高時，藥品污染的TAMC和TYMC無顯著性變化，而樣品置低aw環(huán)境時（aw為 0.328 和 0.529），除了藥品成分不能提供營養(yǎng)，環(huán)境aw也不能滿足微生物生長代謝所需的最低水分子要求，初始污染微生物逐漸死亡，TAMC和TYMC較初始值緩慢減低。詳見圖1 B及圖1 C。

圖1 藥品在不同aw環(huán)境儲存的aw、TAMC、TYMC隨時間變化的曲線圖

3 討論

3.1 指標價值

aw影響微生物代謝活性，大多數(shù)微生物的代謝活動需要水分子參與，aw的降低會導致微生物的代謝活性降低[5]。微生物在aw較高時生長較旺盛，在aw較低時生長緩慢，每種微生物都有1個臨界aw，當樣品aw低于該臨界值時，微生物不能正常生長繁殖[6]，數(shù)量逐步衰減直至死亡，最后該樣品達到無菌狀態(tài)。如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門氏菌等革蘭陰性菌在aw低于0.91時不能增殖（甚至不能存活）；金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌在aw低于0.86時不能增殖；黑曲霉在aw低于0.77時不能增殖；嗜滲酵母和耐旱真菌在aw低于0.60時不能增殖[7]。aw對微生物的致死作用，與微生物細胞內(nèi)外的aw息息相關(guān)，當微生物處在低于臨界aw環(huán)境時，細胞內(nèi)水分就會瞬間流失，伴隨細胞內(nèi)細胞質(zhì)體積的縮小，從而導致細胞的質(zhì)壁分離[8-9]。

aw是控制微生物污染風險和維持穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)工藝中常將食品控制在較低aw范圍內(nèi)，從而抵制由微生物導致的腐敗變質(zhì)，例如干制水果、糖漿劑、和腌制肉、蔬菜等低aw食品具有自我保鮮能力[9-10]。將藥品aw控制在較低范圍內(nèi)，同樣可阻止自身及環(huán)境污染微生物的生長繁殖，然而，將aw應(yīng)用于藥品微生物控制的研究較少，僅有少量國際藥品企業(yè)在新藥研發(fā)階段，將aw作為控制微生物污染的重要參數(shù)進行研究，確保藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性，而該研究在國內(nèi)藥品領(lǐng)域尚屬空白。

3.2 控制藥品aw的意義

aw是控制藥品微生物污染風險和維持藥品穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[11-13]。USP 41指出，藥品aw的降低可提高藥品的抑菌性，阻止微生物增殖；減少處方對微生物污染的敏感性；減少處方中活性成分水解；為減少微生物限度和控制菌檢查頻次的參數(shù)放行提供支持；并為微生物風險控制提供一種替代方法。

3.3 如何在藥品生產(chǎn)和儲存過程保持低aw

在藥品研發(fā)過程，aw可作為固定參數(shù)指標優(yōu)化處方，降低處方中aw，提高藥物制劑的抑菌性，通過在處方中改變氯化鈉、蔗糖、酒精、丙二醇或甘油的濃度達到降低藥品aw的目的。USP 41指出，加強包裝研究，以確保包裝密閉性，從而有效防止環(huán)境水分子在儲存過程進入藥品，導致藥品在aw的增加。

根據(jù)藥品的性質(zhì)和要求，GMP規(guī)定常溫儲存庫保持10～30℃，相對濕度為45% ～75%，冷藏庫保持2～10℃，陰涼庫溫度不超過20℃，陰暗庫溫度不超過20℃并保持避光[14]。儲存環(huán)境濕度較高，空氣中的水蒸氣就會被一些藥品吸收，導致藥品變潮濕，從而發(fā)生霉變、潮解、稀釋及變形等，儲藏環(huán)境濕度比較低，藥品中的結(jié)晶水就會被蒸發(fā)而導致風化[15]。本研究中將藥品儲存于5種不同aw環(huán)境中，由于藥品本身的aw低于這5種環(huán)境aw，導致藥品吸收環(huán)境中的水蒸氣，藥品aw表現(xiàn)出在第1周急劇增加，隨后緩慢增加，并逐漸與環(huán)境aw趨于一致的變化規(guī)律。

3.4 低aw藥品的參數(shù)放行

當藥品aw足夠低，可通過對藥品的風險評估決定是否減少或取消微生物限度和控制菌檢查頻次的參數(shù)放行。風險評估內(nèi)容包括藥品原料、水、生產(chǎn)過程、處方和包裝系統(tǒng)微生物風險控制的有效性證明文件，以及對藥品研發(fā)、生產(chǎn)、過程驗證及大量批次（至少20批）上市樣品常規(guī)試驗的歷史數(shù)據(jù)[14]。

事實上，非水溶性液體制劑和固體制劑等許多非無菌藥物制劑幾乎沒有微生物污染的可能性，分析其原因可能為這些藥物制劑本身aw較低，不適合孢子萌發(fā)和微生物生長[16]。婦康片的初始aw僅為0.317，將藥品置低aw環(huán)境時，樣品TAMC和TYMC隨著時間的延長有降低趨勢，而置較高aw環(huán)境時，樣品TAMC和TYMC隨著時間的延長呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。因此，對該類藥物制劑進行微生物參數(shù)控制的意義不大，可考慮根據(jù)歷史檢測數(shù)據(jù)和有效證明文件進行微生物指標的參數(shù)放行，或采用aw取代微生物指標的檢測。aw檢測具有操作簡便、成本低、周期短等優(yōu)點，一般檢測1次藥品aw約需30 min，而檢測微生物指標的時間為5～7 d。采用藥品aw替代微生物指標可顯著減少藥品放行周期，加快樣品流轉(zhuǎn)速度，降低庫存成本和檢驗費用，提高藥品生產(chǎn)產(chǎn)值，實現(xiàn)從終端控制到源頭過程控制的理念。