王 慧 ，邵義熊 ，阮自琴 ，毛 敏

（1.湖北省十堰市婦幼保健院口腔科，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院口腔科，湖北 十堰 442000）

口腔鱗狀細胞癌（簡稱口腔鱗癌）是常見的頭頸部腫瘤，患者5年生存率僅為53%[1-2]。咀嚼檳榔、吸煙、飲酒等會持續(xù)產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物。過量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生會介導(dǎo)DNA損傷和／或脂質(zhì)過氧化，這些均已被證實能加快口腔鱗癌的發(fā)展[3-4]。研究表明，口腔鱗癌患者唾液中的氧化應(yīng)激標志物[如8-羥基-2′-脫氧鳥苷和丙二醛（MDA）]水平高于健康人群，而抗氧化劑維生素C和維生素 E水平則較低[5]。還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶（Nox／Duox）家族是產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物的酶家族，可在癌癥的進程中發(fā)揮重要作用。上調(diào)Nox1表達和隨后生成的氧化應(yīng)激產(chǎn)物可促進癌細胞增殖[6-7]。紫花前胡素為紫花前胡的醇提物，有祛痰解痙、抗血小板聚集和抗炎作用，并可抑制癌細胞的生長和代謝[8-9]。本研究中探討了紫花前胡素通過Nox1／Akt信號通路抑制口腔鱗癌細胞增殖及侵襲的作用，為口腔鱗癌的治療提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：MilliCell室（美國 Millipore公司）；SpectraMax M5型分光光度計（美國MolecularDevices公司）；IX73型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；FACSCantoⅡ型流式細胞儀（美國BD公司）；NanoDrop 2000型分光光度計（美國 Thermo Fisher Scientifc公司）；Applied Biosystems 7500型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)（qPCR，美國Applied Biosystems公司）。

試藥：10%胎牛血清（FBS），DMEM培養(yǎng)基，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；四氮唑鹽（MTT，德國Sigma-Aldrich 公司）；4′，6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI），0.5% 結(jié)晶紫，均購自美國 Sigma 公司；Matrigel基質(zhì)（美國BD公司）；RNA試劑盒、Ex Taq酶，均購自日本Takara公司。

細胞：口腔鱗癌SCC-25細胞，源自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)及分組：SCC-25組（A組）及紫花前胡素低、中、高劑量組（B1組、B2組、B3組）取 10 mL SCC-25細胞（密度為5×106／mL）置有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，各組分別加入紫花前胡素 0，20.0，40.0，80.0μg／mL，置 CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，2%O2，93%N2）。以上各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

細胞增殖水平檢測：采用四氮唑鹽（MTT）比色法評估。取上述各組細胞，每孔中加入MTT溶液。孵育4 h后，加入裂解緩沖液（10%SDS 加入 0.01 mol／L HCl中）并孵育過夜。最后，使用分光光度計測定550 nm波長處的吸光度（OD），計算存活率及凋亡率。

細胞單克隆形成數(shù)目檢測：取上述各組細胞，用胰蛋白酶處理，計數(shù)，并在密度為103細胞／孔的6孔板中用完全培養(yǎng)基重新接種8 d。每3 d更換培養(yǎng)基，以維持細胞生長。將菌落固定，并用0.5%結(jié)晶紫在室溫下染色30 min。培養(yǎng)8 d后，在倒置顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。

細胞體外侵襲試驗：在MilliCell（直徑12 mm，孔徑8 μm）室上側(cè)預(yù)涂Matrigel。在補充有0.1%血清的培養(yǎng)基中將1×105個上述各組細胞加入上部隔室中，并將該室置含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基的24孔板中。在37℃下培養(yǎng)24 h后，擦去膜上側(cè)的細胞，將下膜表面上的侵入細胞固定，并用DAPI染色。通過計數(shù)每個室10個高功率氈的穿膜孔數(shù)來量化侵入活動。

細胞凋亡水平：使用基于Annexin V（Axv）-FITC／PI雙染色的流式細胞（FACS）分析。室溫下在Axv-FITC和 PI（10 μg ／mL）中溫育 15 min，使用流式細胞儀測定熒光強度。

細胞Nox1 RNA及P-Akt RNA表達水平：采用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法測定。從上述各組細胞中提取總RNA。以分光光度計測定RNA濃度。確保濃度比值水平為 2.60～2.80，PCR 系統(tǒng)上用SYBR預(yù)混物Ex Taq進行qPCR。GAPDH mRNA用于標準化 RNA 比對。引物序列如下，Nox1（5′-GCAACCAATGGATCTCCTCCT-3′和 5′-GGGGAGAAAAACACCCCGAA-3′），P-Akt（5′-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3′和 5′-TCCGGGGACAGCATCAAATC-3′），GAPDH（5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′和 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′）。熱循環(huán)條件，40 個循環(huán)，在95℃下變性10s，在60℃下退火10s，在72℃下延伸15 s。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法處理。平行測定3次。

細胞氧化應(yīng)激水平：取上述各組細胞，5 000 r／min離心收集細胞，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）制成細胞懸液后，以酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶（SOD）、MDA、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表4。

表1 各組SCC-25細胞OD值、存活率及凋亡率水平比較（n=6）

表2 各組SCC-25細胞克隆形成數(shù)目及穿膜數(shù)比較（n=6）

表3 各組SCC-25細胞Nox1及 P-Akt mRNA表達水平比較（n=6）

表4 各組SCC-25細胞氧化應(yīng)激水平比較（n=3）

3 討論

口腔鱗癌為常見惡性腫瘤，對放射治療和化學療法反應(yīng)較差。紫花前胡素是一種天然的異丙基甲酚，具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗氧化和抗血管生成的作用[10]。肝癌細胞體外試驗證實，紫花前胡素可通過一系列生物學途徑抑制肝癌細胞的增殖，包括細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生、黏附和侵襲。此外，紫花前胡素對肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細胞也具有一定抗增殖作用[11]。本研究結(jié)果顯示，B1組、B2組、B3組的OD值、存活率、細胞克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)水平低于A組，凋亡率水平高于A組，這與上述文獻結(jié)論相符合。同時提示，紫花前胡素能抑制口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲，并促進其凋亡。

Nox／Duox家族由7名成員組成，被認為是氧化應(yīng)激產(chǎn)物生成的主要來源，其在癌癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12]。據(jù)報道，對Nox1活性的抑制可誘導(dǎo)許多癌細胞（包括胰腺癌、間皮瘤和肉瘤）凋亡。RT-PCR分析顯示，Nox1 mRNA和Nox4 mRNA在肺癌細胞系的重要亞組中呈高度表達[12]。基因敲除Nox1，可顯著抑制肺癌細胞活力。Nox1還能抑制p53（K382）的乙酰化，后者是SiRT1脫乙酰酶的靶標，并抑制了p53促凋亡轉(zhuǎn)錄活性[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢細胞癌中，Nox1的敲低顯著增強了順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡。這一新發(fā)現(xiàn)提示了Nox1可能是癌細胞治療的一個重要潛在靶點[14]。本研究結(jié)果顯示，B1組、B2組、B3組的Nox1mRNA表達水平低于A組。說明紫花前胡素能抑制Nox1的表達，進而降低口腔鱗癌細胞的活性。

Akt是細胞存活的調(diào)節(jié)因子，通過其磷酸化活化抑制凋亡，從而防止細胞死亡和延長細胞存活期[15-16]。選擇性抑制劑作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K／Akt）對非小細胞肺癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤和頭頸部鱗狀細胞癌療效較好[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)，B1組、B2組、B3組的 Nox1 mRNA和P-Akt mRNA表達水平低于A組，提示紫花前胡素可通過抑制Nox1活性，降低Akt的磷酸化水平，進而加速口腔鱗癌細胞的凋亡。

由氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平分析結(jié)果可知，B1組、B2組、B3組的SOD和GSH-Px水平高于A組，MDA水平低于A組。提示紫花前胡素能明顯降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，進而抑制癌細胞的增殖及侵襲。這與上述文獻的結(jié)果相符。

綜上所述，紫花前胡素能抑制口腔鱗癌細胞增殖、侵襲，并促進其凋亡，其機制與紫花前胡素抑制Nox1活性并降低Akt的磷酸化水平，從而降低其氧化應(yīng)激水平有關(guān)。但本研究中只探討了紫花前胡素對Nox1 mRNA及Akt mRNA表達的影響，未探討紫花前胡素對口腔鱗癌細胞Nox1／Akt信號通路上下游細胞因子表達的影響，這將在后續(xù)研究中進行。