金超超 金 諾 梅 芬 趙梅鳳

目前，臨床上對(duì)于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的首選治療手段為手術(shù)切除，術(shù)后輔助放化療為其治療原則，但隨著NSCLC患者的逐漸增多，有研究顯示，予以相同方案進(jìn)行治療的不同NSCLC患者其治療效果和預(yù)后情況也可存在一定的差異，故除去治療方案外，探討影響NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)因素是目前臨床上一個(gè)值得重視的問(wèn)題[1]。隨著研究的不斷深入，有資料顯示，在不同治療效果和預(yù)后的NSCLC患者間其相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子等均存在著一定的差異[2]，故有學(xué)者認(rèn)為相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的表達(dá)可能與NSCLC患者的預(yù)后有著密切聯(lián)系，但具體指標(biāo)尚未闡述清楚[3]。本文通過(guò)回顧性分析100例NSCLC患者的臨床及隨訪資料，旨在探討NSCLC患者癌組織中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年至2012年我院收治的100例NSCLC患者作為研究對(duì)象，其中男性76例，女性24例，年齡為36～80歲，平均年齡為(62.02±9.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合2004年世界衛(wèi)生組織(WHO)中肺癌明確診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②所有患者均在完善術(shù)前準(zhǔn)備后行手術(shù)治療且術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC；③本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；④所有患者均知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重原發(fā)性肝腎功能不全者；②除去NSCLC外存在其他肺部疾病者；③存在其他惡性腫瘤者；④臨床及隨訪資料不完整者。

1.2 研究方法

選取100例NSCLC并行手術(shù)治療患者，并于術(shù)中收集其切取的NSCLC癌變組織100份作為研究組，另在手術(shù)過(guò)程中收集100份癌旁正常組織作為對(duì)照組，2組組織標(biāo)本均采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行HMGB1、MMP-9和FOXP3水平的檢測(cè)。所有患者出院后均進(jìn)行5年時(shí)間的隨訪，隨訪率為100%。

免疫組化所需試劑：HMGBl抗體購(gòu)Ih abcam公司(79823)，MMP-9抗體，濃縮的人類FOXP3型鼠抗單克隆抗體原液，氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑，DEPC水購(gòu)自碧云天，即用型ChemMate EnVision兔/鼠通用型免疫組化試劑盒、3%H2O2離子水、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(Tris．EDTA)、丙氨基三乙氧基硅烷(APES)、丙酮(AR)、無(wú)水乙醇(AR)、95%乙醇(AR)、二甲苯(AR)、蘇木精體細(xì)胞快速顏色液、pH試紙、鹽酸(AR)和氨水(AR)。檢測(cè)方法：HMGB1、MMP-9和FOXP3均采用免疫組織化學(xué)染色(PV-9000 二步法)，一抗分別為HMGBl(1∶100)、 MMP-9(即用型)和Foxp3(1∶40)，用PBS替代一抗做陰性對(duì)照，試劑商提供的陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)其資料及檢測(cè)結(jié)果記錄所有患者的性別、年齡等一般臨床資料及腫瘤情況、HMGB1、MMP-9和FOXP3的水平及預(yù)后，并比較不同預(yù)后患者間HMGB1、MMP-9和FOXP3水平等相關(guān)資料的差異性。HMGB1、MMP-9和FOXP3陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：HMGB1和FOXP3[5]：采用IHS=A×B來(lái)表示，其中A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在0～1%之間為0，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在>1%～25%之間為1，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在>25%～50%之間為2，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在>50%～75%之間為3，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在>75%～100%之間為4；B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度，無(wú)著色=0，淡黃色=1，棕黃色=2，棕褐色=3，IHS≥3分為陽(yáng)性表達(dá)，其中0～2 分為(-)，3～4 分為(+)，6～8 分為(++)，9～12 分為(+++)。MMP-9[6]：表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，且在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)應(yīng)清晰可見、定位準(zhǔn)確，而背景不著色。在高倍鏡下取4個(gè)不同的視野，并數(shù)200個(gè)癌細(xì)胞，根據(jù)MMP-9 陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率判定 MMP-9 表達(dá)強(qiáng)弱。陰性(-)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例小于10%；弱陽(yáng)性(+)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例為 10%～25%；中度陽(yáng)性(++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例為 25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例>50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組組織標(biāo)本中HMGB1、MMP-9和FOXP3表達(dá)水平比較

NSCLC患者其癌變組織中HMGB1、MMP-9和FOXP3的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于癌旁正常組織，比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組組織標(biāo)本中HMGB1、MMP-9和FOXP3表達(dá)水平比較/例

2.2 預(yù)后生存情況

研究100例NSCLC患者中，自出院后至隨訪結(jié)束存活1～50個(gè)月，中位生存時(shí)間為42個(gè)月，出院后1年生存率為90.00%(90/100)，3年生存率為82.00%(82/100)，5年生存率為68.00%(68/100)。HMGB1陰性患者和陽(yáng)性患者其5年總生存率分別為86.67%(26/30)和60.00%(42/70)，MMP-9陰性和陽(yáng)性患者其5年總生存率分別為93.75%(15/16)和63.10%(53/84)，而FOXP3陰性和陽(yáng)性患者其5年總生存率分別為85.00%(34/40)和56.67%(34/60)，比較差異間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.863，P=0.009；χ2=5.804，P=0.016；χ2=8.854，P=0.003)。

2.3 影響預(yù)后的單因素分析

經(jīng)非條件單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，吸煙、腫瘤低分化、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽(yáng)性表達(dá)和臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的NSCLC患者其5年生存率均顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4 影響預(yù)后的多因素分析

經(jīng)多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽(yáng)性均為影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

3 討論

本組研究結(jié)果顯示，在NSCLC患者當(dāng)中，其癌變組織中的HMGB1、MMP-9和FOXP3表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織，由此可見HMGB1、MMP-9和FOXP3與NSCLC疾病的發(fā)生和進(jìn)展有著一定的聯(lián)系。本組研究結(jié)果還顯示，吸煙、腫瘤低分化、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽(yáng)性表達(dá)和臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的NSCLC患者其5年生存率均顯著降低，由此則進(jìn)一步表明HMGB1、MMP-9、FOXP3在機(jī)體中的表達(dá)與NSCLC患者疾病進(jìn)展和預(yù)后有著密不可分的關(guān)系，但關(guān)于其具體機(jī)制尚未完全報(bào)道。結(jié)合以往生化學(xué)研究[7]可知，HMGB1被認(rèn)為是一種與腫瘤疾病發(fā)生和進(jìn)展有著密切相關(guān)的促癌基因，其可一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移能力。故本研究認(rèn)為，隨著HMGB1表達(dá)水平的增加，其陽(yáng)性率越高，則可增加腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，從而進(jìn)一步加速病情發(fā)展和提高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和病情惡化，進(jìn)而縮短生存時(shí)間[8]。而MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分具有一定的降解作用，從而可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基膜向周圍組織浸潤(rùn)，促進(jìn)癌細(xì)胞向周圍正常組織侵襲，進(jìn)一步加重機(jī)體的損傷導(dǎo)致其功能出現(xiàn)不可逆的下降和減退直至壞死[9]。另一方面，還有資料顯示，MMP-9對(duì)相關(guān)毛細(xì)血管的內(nèi)生具有一定的促進(jìn)作用，從而造成新血管給腫瘤細(xì)胞進(jìn)行血氧營(yíng)養(yǎng)成分的供給而促進(jìn)其生長(zhǎng)[10]。FOXP3屬于FOX家族的一員，其可一定程度上調(diào)控CD4+和CD25+的表達(dá)，從而對(duì)T細(xì)胞的分化和活化等具有一定的調(diào)控作用，出現(xiàn)免疫應(yīng)答被抑制等情況，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃離相關(guān)免疫作用而繼續(xù)生長(zhǎng)[11]。由此可見，HMGB1、MMP-9和FOXP3與NSCLC的生長(zhǎng)均有著密切聯(lián)系，隨著其表達(dá)水平的上升，腫瘤進(jìn)展越快對(duì)機(jī)體損害越大從而導(dǎo)致生存時(shí)間越短。且本文也經(jīng)多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析進(jìn)一步證實(shí)腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽(yáng)性均為影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 影響預(yù)后的多因素分析

綜上所述，HMGB1、MMP-9和FOXP3在NSCLC患者癌組織中均以較高水平表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)聯(lián)合腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期和出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。