趙 瑋 齊燕妮 張建平 趙 利 王利民 謝亞萍 王 斌 張艷萍

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070)

胡麻(油用亞麻)屬于亞麻科(Lianceace)亞麻屬(Linum)[1]，由于它的營養(yǎng)價值和工業(yè)價值，逐漸引起了廣泛關(guān)注，成為我國西北和華北地區(qū)重要的特色油料作物[2]，在甘肅的種植面積和總產(chǎn)均居全國首位[3]。甘肅是我國鹽堿地面積較大的省份之一，目前我國鹽堿地面積有1億hm2[4]，甘肅的耕地中就有鹽堿土壤12.0萬公頃[5]，胡麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展面臨著鹽漬脅迫的威脅，篩選、培育耐鹽堿的優(yōu)良品種是應(yīng)對土壤鹽漬化問題最經(jīng)濟(jì)有效的辦法之一[6]，對促進(jìn)胡麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

種子萌發(fā)乃萬物生長的起始，這個階段又是對逆境脅迫極為敏感的時期[7]，此階段的耐鹽情況在一定程度上反映了該品種的耐鹽能力，是耐鹽植物篩選與早期鑒定的主要依據(jù)之一[8]，因此萌發(fā)期的耐鹽性鑒定至關(guān)重要。有關(guān)亞麻種質(zhì)資源萌發(fā)期的耐鹽性篩選和評價已有一些研究，郭媛[9]等對342份亞麻種質(zhì)萌發(fā)期的耐鹽堿性進(jìn)行了篩選和評價，篩選出了5份高耐性纖用亞麻品種；于瑩[10]等對16份亞麻品種進(jìn)行了萌發(fā)期耐鹽性鑒定，篩選出黑亞19、Agatha、黑亞17號具有較強的耐鹽能力；已有的研究結(jié)果多集中于纖用亞麻方面，關(guān)于油用亞麻(胡麻)的研究還比較欠缺。因此，本研究選用一定濃度的NaCl溶液對28份胡麻資源進(jìn)行脅迫，調(diào)查萌發(fā)期11個不同性狀指標(biāo)，通過因子和主成分分析、聚類分析和回歸分析，綜合評價不同胡麻資源的萌發(fā)期耐鹽能力，同時探索胡麻萌發(fā)期耐鹽性鑒定的關(guān)鍵篩選指標(biāo)，為室內(nèi)進(jìn)行快速耐鹽性鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的28份胡麻資源來源見表1，其中1份引自加拿大，7份為國家特色油料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系胡麻相關(guān)育種崗位專家選育的新品系，其余20份由甘肅省農(nóng)科院作物研究所胡麻資源庫提供。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2018年6月在25℃的恒溫組培室進(jìn)行。各資源選取籽粒飽滿的種子，用70%的乙醇溶液殺菌1 min，無菌水沖洗4～5次，吸干種子表面水份，置于鋪有2層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿30粒種子。

為了確定適宜的鹽濃度，做了鹽濃度篩選預(yù)實驗。選用隴亞10號和R24號2個品種資源作為材料，設(shè)置了6個NaCl溶液濃度0(CK)、50、100、150、200、250 mmol·L-1進(jìn)行試驗。通過發(fā)芽率、總鮮重、胚根、下胚軸的生長狀況(表2)，確定出用濃度100 mmol·L-1的NaCl溶液進(jìn)行脅迫試驗比較適宜。

每培養(yǎng)皿加入15 ml 100 mmol·L-1的NaCl溶液，對照中加入15 mL蒸餾水，均三次重復(fù)，做好相應(yīng)標(biāo)記后置于恒溫組培室黑暗處進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。從第3天開始統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，一直統(tǒng)計到第7天，并在第7天測量相關(guān)指標(biāo)，每培養(yǎng)皿測量10株。

1.3 測定指標(biāo)與計算方法

發(fā)芽以胚根長度達(dá)種子長為標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)芽7天后統(tǒng)計發(fā)芽率，直尺法測量下胚軸長、胚根長，使用千分之一電子天平測量芽苗總鮮重、下胚軸鮮重、胚根鮮重、下胚軸干重、胚根干重等性狀指標(biāo)。

表1 28份胡麻資源及來源

發(fā)芽勢=第3天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽率=第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)Gi=∑(Gt/Dt)

(3)

式中：Dt為發(fā)芽日數(shù)；Gt為相對應(yīng)的每日發(fā)芽種子數(shù)。

活力指數(shù)Vi=發(fā)芽指數(shù)Gi×芽苗總鮮重

(4)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)的處理，相對值=鹽脅迫下的各指標(biāo)測定值/無鹽脅迫下的各指標(biāo)測定值；用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、因子和主成分分析、聚類分析和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻萌發(fā)期鹽脅迫濃度篩選

兩個胡麻資源經(jīng)不同濃度的NaCl溶液脅迫(表2)，除隴亞10號的發(fā)芽率在50 mmol·L-1處理下(91.11%)較CK(85.55%)有所上升外，兩資源的其它生長指標(biāo)較CK均表現(xiàn)為隨著鹽脅迫的增強而降低。在50 mmol·L-1處理下，隴亞10號的發(fā)芽率(91.11%)和總鮮重(0.64 g)較CK(85.55%；0.75 g)變化差異均不顯著，下胚軸長(4.66cm)和胚根長(3.99 cm)較CK(6.39 cm；5.02 cm)降低幅度差異顯著；R24號的總鮮重(0.38 g)和胚根長(2.61 cm)較CK(0.51 g；3.63 cm)下降差異均不顯著，發(fā)芽率(66.67%)和下胚軸長(2.40 cm)較CK(83.34%；6.36 cm)降低幅度差異顯著；當(dāng)鹽脅迫增加到100 mmol·L-1時，除兩個資源的發(fā)芽率外，其它生長指標(biāo)均較CK有大幅度降低(50%以上)，差異顯著；當(dāng)鹽脅迫增加到150 mmol·L-1時，兩資源的下胚軸生長幾乎都受到抑制，胚根的生長較CK降低幅度超過85%以上；鹽脅迫達(dá)到200 mmol·L-1時，生長受到嚴(yán)重抑制，無明顯下胚軸和胚根。

表2 NaCl脅迫濃度篩選

注：“—”無明顯下胚軸和胚根；表中同列標(biāo)有不同字母為5%水平差異顯著；GT.發(fā)芽率； TFW.總鮮重； HL.下胚軸長；RL.胚根長

Note：“—”means that the germinated seeds no significant hypocotyl and radicle; In the table,different letters in the same column mean significant differences(P<0.05)；GT.Germination rate； TFW.Total fresh weight； HL.Hypocotyl length；RL.Radicle l length

表3 鹽脅迫下28份胡麻資源萌發(fā)期各指標(biāo)變化

注：“**” 在1%水平顯著相關(guān)；GP.發(fā)芽勢；GT.發(fā)芽率；GI.發(fā)芽指數(shù)；VI.活力指數(shù)；TFW.總鮮重；HFW.下胚軸鮮重；HDW.下胚軸干重；RFW.胚根鮮重；RDW.胚根干重；HL.下胚軸長；RL.胚根長

Note：“**” mean that correlation is significant atP<0.01;GP.Germination potential；GT.Germination rate；GI.Germination index；VI.Vigor index；TFW.Total fresh weight；HFW.Hypocotyl fresh weight；HDW.Hypocotyl dry weight；RFW.Radicle fresh weight；RDW.Radicle dry weight；HL.Hypocotyl length；RL.Radicle l length

表4 鹽脅迫下各指標(biāo)耐鹽相對值的相關(guān)系數(shù)

注：“**”在0.01水平顯著相關(guān)；“*”在0.05水平顯著相關(guān)；RGP.相對發(fā)芽勢；RGT.相對發(fā)芽率；RGI.相對發(fā)芽指數(shù)；RVI.相對活力指數(shù)；RTFW.相對總鮮重；RHFW.相對下胚軸鮮重；RHDW.相對下胚軸干重；RRFW.相對胚根鮮重；RRDW.相對胚根干重；RHL.相對下胚軸長；RRL.相對胚根長(下同)

Note：“**” mean that correlation is significant atP<0.01;“*” mean that correlation is significant atP<0.05;RGP.Relative germination potential；RGT.Relative germination rate；RGI.Relative germination index；RVI.Relative vigor index；RTFW.Relative total fresh weight；RHFW.Relative hypocotyl fresh weight；RHDW.Relative hypocotyl dry weight；RRFW.Relative radicle fresh weight；RRDW.Relative radicle dry weight；RHL.Relative hypocotyl length；RRL.Relative radicle l length The same as below.

2.2 鹽脅迫對胡麻萌發(fā)期各指標(biāo)的影響

經(jīng)100 mmol·L-1的NaCl溶液脅迫，28份胡麻資源的各指標(biāo)值均受到不同程度的抑制(表3)。依據(jù)鹽脅迫前后均值降低的幅度看，降低較大的是下胚軸長、下胚軸鮮重、胚根長，分別較CK降低了75.67%、74.96%和68.43%，(P<0.01)；其次降低幅度明顯的是胚根鮮重、胚根干重、下胚軸干重、活力指數(shù)和總鮮重等指標(biāo)，分別較CK降低了58.01%、57.21%、57.79%、52.46%和44.25%，(P<0.01)；發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)降低幅度較小，分別較CK降低了6.10%、4.95%、16.43%，(P<0.01)。從變異系數(shù)看，受鹽脅迫的變異系數(shù)均較CK有不同程度的增加，說明各指標(biāo)對鹽脅迫都表現(xiàn)敏感，差異變大，尤其是下胚軸的生長對脅迫最為敏感，其鮮重和長度較CK的變化系數(shù)達(dá)43.3%和31.64%；其次是胚根表現(xiàn)敏感，其鮮重和長度較CK的變化系數(shù)達(dá)16.38%和11.15%。

2.3 鹽脅迫下各指標(biāo)的相關(guān)性

對11個指標(biāo)的相對值進(jìn)行相關(guān)性分析表明(表4)：發(fā)芽勢(除與發(fā)芽率)、發(fā)芽率(除與總鮮重)、發(fā)芽指數(shù)(除與活力指數(shù))與各指標(biāo)之間無相關(guān)性，其余指標(biāo)之間互相都存在極顯著的正相關(guān)。其中下胚軸鮮重與下胚軸長、下胚軸干重的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.971**、0.947**；胚根鮮重與胚根干重、胚根長的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.964**、0.855**；總鮮重與下胚軸鮮重、下胚軸干重、下胚軸長相關(guān)性達(dá)到0.931**、0.932**、0.891**；活力指數(shù)與總鮮重相關(guān)性為0.884**；下胚軸干重與下胚軸長的相關(guān)系數(shù)為0.898**；胚根干重與胚根長的相關(guān)系數(shù)為0.853**。

2.4 因子和主成分分析

將鹽脅迫下胡麻參試材料11個指標(biāo)的相對值用SPSS 22.0軟件進(jìn)行因子和主成分分析，根據(jù)累計方差占總方差的85%以上和特征值大于等于1兩條重要原則[11]，轉(zhuǎn)換成了3個主成分綜合指標(biāo)(表5)，第Ⅰ主成分的貢獻(xiàn)率為59.080%，第Ⅱ主成分的貢獻(xiàn)率為16.968%，第Ⅲ主成分的貢獻(xiàn)率為11.166%，可有效解釋原11個指標(biāo)87.213%的信息量。

表5 主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率

Table 5 Eigen values of principal components and their contributions

主成分Principal component特征值Eigen value貢獻(xiàn)率Contribution(%)累計貢獻(xiàn)率Cumulative contribution(%)16.49959.0859.0821.86616.96876.04731.22811.16687.213

表6 各因子載荷矩陣

表7 特征向量矩陣

表8 28份胡麻材料萌發(fā)期耐鹽性排序

由表6可看出，第一主成分主要反映的是下胚軸長勢情況，在下胚軸鮮重、下胚軸干重以及下胚軸長和總鮮重上具有較高的載荷量，可稱為下胚軸生長因子；第Ⅱ主成分在胚根鮮重、胚根干重以及胚根長上具有較高的載荷量，主要反映的是胚根長勢情況，可稱為胚根生長因子；第Ⅲ主成分在發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及發(fā)芽指數(shù)上具有較高的載荷量，主要反映的是胡麻萌發(fā)的情況，可稱為種子萌發(fā)因子。

2.5 耐鹽性綜合評價

通過對各因子的主成分分析，獲得3個主成分的特征向量矩陣(表7)，從而獲得主成分的得分公式，如下：

Z1=-0.056X1-0.188X2+0.185X3+0.498X4+0.517X5+0.498X6+0.493X7+0.444X8+0.481X9+0.499X10+0.442X11

Z2=0.496X1+0.483X2+0.081X3-0.012X4-0.052X5-0.048X6-0.037X7+0.125X8+0.099X9-0.033X10+0.207X11

Z3=-0.137X1-0.056X2+0.444X3+0.140X4-0.101X5-0.171X6-0.187X7+0.146X8+0.113X9-0.148X10+0.030X11

式中：X為因子分析中的各原始變量標(biāo)準(zhǔn)化后相對應(yīng)的變量，X1：相對發(fā)芽勢；X2：相對發(fā)芽率；X3：相對發(fā)芽指數(shù)；X4：相對活力指數(shù)；X5：相對總鮮重；X6：相對下胚軸鮮重；X7：相對下胚軸干重；X8：相對胚根鮮重；X9：相對胚根干重；X10：相對下胚軸長；X11：相對胚根長；根據(jù)Z1、Z2和Z3的值，各資源耐鹽綜合得分公式：Z=6.499Z1+1.866Z2+1.228Z3。

圖1 28份胡麻材料萌發(fā)期耐鹽性的系統(tǒng)聚類圖Fig.1 System clustering of salt tolerance of 28 flax materials during germination

根據(jù)公式算出各品種的綜合Z值，對28份胡麻資源萌發(fā)期的耐鹽性進(jìn)行排序(表8)。采用歐氏距離平方和分層聚類法對28份胡麻資源的Z值進(jìn)行耐鹽性聚類分析(圖1)，在歐式距離為5處，可將28份胡麻資源聚成4個類群。

第一類群(5份)，占供試材料的17.86%，分別為雁雜10號、輪選1號、隴亞4號、R40號和DYMS，Z值在大于20小于50之間，其中雁雜10號、輪選1號Z值在40以上，屬于強耐鹽材料；隴亞4號、R40號、DYMSZ值分別為33.596、28.148、25.716，屬于較強耐鹽材料。

第二類群(11份)，占供試材料的39.29%，Z值在-2和20之間，屬于中等耐鹽類型。其中伊亞4號、晉亞1號、天亞1號、隴亞10號、寧亞6號、伊亞3號等6個材料，Z值在大于7小于20之間，屬于中等偏耐鹽型；其中輪選3號、R196號、內(nèi)亞油1號、內(nèi)亞6號、晉亞8號聚為一組，Z值在大于-2小于2之間，屬于中等偏鹽敏感型。

第三類群(9份)，占供試材料的32.14%，Z值在-25和-7之間，屬于鹽敏感類型。分別為定亞17號、甘亞3號、R119號、R30號、隴亞雜1號、STS、R24號、R68號、壩亞6號等材料。

第四類群(3份)，占供試材料的10.71%，分別為甘亞2號、定亞5號、R84號等材料，Z值分別為-37.801、-38.551、-40.242，屬于高度鹽敏感類型。

2.6 耐鹽鑒定回歸方程的建立

把耐鹽性鑒定綜合Z值作因變量，各相對值作為自變量，通過逐步回歸分析獲得多元線性逐步回歸方程：

Z=-155.359+126.107X5+89.940X9+39.447X3+53.582X10(R2=0.990)

式中：X5、X9、X3、X10分別代表相對總鮮重、相對胚根干重、相對發(fā)芽指數(shù)和相對下胚軸長等指標(biāo)。回歸模型經(jīng)回歸系數(shù)測驗和決定系數(shù)驗證，都達(dá)極顯著水平，表明胡麻種子在鹽脅迫下，總鮮重、胚根干重、發(fā)芽指數(shù)和下胚軸長等指標(biāo)可作為其耐鹽能力鑒定的關(guān)鍵指標(biāo)。

3 討論

植物逆境脅迫臨界值一般是以各形態(tài)指標(biāo)受抑制率為50%來確定[12]。本研究預(yù)實驗中2個胡麻資源在6個NaCL溶液濃度中進(jìn)行了萌發(fā)生長比較，在100 mmol·L-1的NaCL溶液脅迫下，除發(fā)芽率受鹽脅迫影響較小外，其它生長指標(biāo)值均較對照都有顯著下降，超過了50%。鹽脅迫增加到150和200 mmol·L-1時，下胚軸和胚根的生長依次受到完全抑制。作物耐鹽堿能力是多種代謝的綜合表現(xiàn)[13]，單一指標(biāo)或者少量指標(biāo)是難以全面反映作物耐鹽強弱的[14]，要對胡麻耐鹽性綜合評價，就需要從多個指標(biāo)進(jìn)行綜合考察，故選擇100 mmol·L-1的NaCL溶液濃度作為胡麻萌發(fā)期耐鹽性綜合評價的篩選濃度是合理的。

鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響，一方面是滲透脅迫，一方面是離子毒害[15]。這兩方面偶聯(lián)作用抑制種子的萌發(fā)和幼苗的生長。本研究中，胡麻參試材料11個指標(biāo)根據(jù)變化率和變異系數(shù)的比較分析可以看出，均對鹽脅迫表現(xiàn)出不同程度的敏感，其中下胚軸的生長最為敏感，胚根的生長為次敏感，發(fā)芽率表現(xiàn)出較不敏感，此結(jié)論與于瑩[16]對纖用亞麻的研究和姜珊[17]對樹種萌發(fā)的研究一致。這可能與不同部位對鹽脅迫的響應(yīng)機制和耐受力不同的因素有關(guān)。在玉米[18]、小麥[19]、辣椒[20]的研究中有報道，植物的不同器官或組織，或同一組織中的不同細(xì)胞，對于同一鹽脅迫的響應(yīng)和耐受閾值會有相當(dāng)大的變化。

作物的耐鹽堿性狀是受多個數(shù)量性狀基因座調(diào)控的復(fù)雜性狀，用不同的指標(biāo)評價同一個品種的抗逆性，就可能會得到不同的結(jié)果[21]，用單一或過少的指標(biāo)進(jìn)行評價會使結(jié)果片面性，運用過多的指標(biāo)又會使鑒定工作繁瑣。本研究對選用的11個指標(biāo)進(jìn)行因子和主成分分析，回歸分析，最終確定出總鮮重、胚根干重、發(fā)芽指數(shù)和下胚軸長這4個指標(biāo)作為胡麻萌發(fā)期耐鹽性室內(nèi)快速鑒定的關(guān)鍵指標(biāo)。通過這4個指標(biāo)根據(jù)回歸方程計算了參試材料的耐鹽性預(yù)測值，有18個材料的排序與綜合評價中的完全一樣，僅14、15、16的排序是在三者之間互換，18與19、21與22以及26與27的排序是在兩者之間互換。用4個指標(biāo)計算出的預(yù)測值與全部指標(biāo)計算出的綜合Z值之間極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9918，表明用篩選出的4個指標(biāo)對28份胡麻材料萌發(fā)期的耐鹽性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性，可以代替原來11個指標(biāo)對胡麻資源萌發(fā)期耐鹽性做出快速評價。

另外，有研究已經(jīng)證實在高粱[22]、玉米[23]和粟米[24]等作物上萌發(fā)期的耐鹽性與植株生長后期的耐鹽性一致，但在小麥和水稻等作物上，發(fā)芽期的耐鹽性與植株生長后期的耐鹽性沒有必然的聯(lián)系[25]。所以胡麻萌發(fā)期耐鹽性是否與其他生育期的耐鹽性相符還有待下一步繼續(xù)研究。