王 琪 許志茹, 陳瑾元 張 雙 黃佳歡 劉關(guān)君*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

金屬離子在生物體內(nèi)具有重要作用。據(jù)估計(jì)，生物體內(nèi)大約超過(guò)一半的蛋白質(zhì)都含有金屬離子。這些金屬離子在生物體的各種代謝反應(yīng)中作為結(jié)構(gòu)組分或催化因子發(fā)揮作用。但是過(guò)量的金屬離子也具有潛在毒性。因此，生物體在進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制確保各種金屬離子穩(wěn)態(tài)。此外，進(jìn)入細(xì)胞的金屬離子會(huì)被蛋白質(zhì)和小分子配體螯合，這些金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過(guò)金屬伴侶蛋白完成的[1～2]。在一些藻類、真菌和動(dòng)物中，存在少量的金屬伴侶-like蛋白。在植物中，此類蛋白形成了大的基因家族，包括兩種類型的蛋白質(zhì)，即重金屬相關(guān)植物蛋白(heavy metal-associated plant proteins，HPPs)和重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白(heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPPs)[3～4]。

HIPPs是維管植物特有的、在非生物脅迫和生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，一般含有113～584個(gè)氨基酸殘基[5]。此類蛋白包含一個(gè)或兩個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域(heavy metal-associated domain)和羧基端(C端)的異戊二烯化基序。大部分HIPPs蛋白在這兩種元件之間存在甘氨酸富集區(qū)和/或脯氨酸富集區(qū)。異戊二烯化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種修飾過(guò)程，異戊二烯化蛋白質(zhì)的一個(gè)典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是蛋白質(zhì)的C端都具有CaaX結(jié)構(gòu)(C代表半胱氨酸；a代表脂肪族氨基酸；X代表C端氨基酸，通常是甲硫氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸或丙氨酸)，此結(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能如蛋白質(zhì)與膜互作、蛋白質(zhì)之間的相互作用是十分重要的[6～8]。1999年，Dykema等人首次描述并鑒定了擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatabacum)中的HIPPs蛋白，并證明此類蛋白可以通過(guò)HMA結(jié)構(gòu)域的核心基序M/LXCXXC(M代表甲硫氨酸，L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸，C代表半胱氨酸)與Cu2+、Ni2+和Zn2+結(jié)合[9]。擬南芥HIPP蛋白家族包括45個(gè)成員，而水稻(Oryzasativa)、毛果楊(Populustrichocarpa)和粟米(Setariaitalica)中分別含有59、74和51個(gè)HIPPs蛋白，這些蛋白被分為5個(gè)不同的類別(clusters)[5]。

目前，關(guān)于HIPPs蛋白的研究多集中于此類蛋白與病原菌侵染和非生物脅迫的相關(guān)關(guān)系等方面。小麥(TriticumaestivumL.)TaHIPP1基因在生物及非生物脅迫條件下差異表達(dá)，Zhang等通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默證實(shí)，TaHIPP1增強(qiáng)了植株對(duì)小麥條銹病(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici，Pst)的易感性，敲低TaHIPP1表達(dá)可以在一定程度上增強(qiáng)小麥對(duì)Pst的抗性[10]。此外，擬南芥HIPP27是甜菜胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)的宿主易感性基因，應(yīng)答甜菜胞囊線蟲侵染其表達(dá)量大量增加。過(guò)量表達(dá)HIPP27可以增加擬南芥對(duì)胞囊線蟲的易感性。擬南芥hipp27突變體對(duì)胞囊線蟲的易感性急劇降低[11]。煙草敲除NbHIPP26后可以阻止馬鈴薯帚頂病毒(potato mop-top virus，PMTV)的長(zhǎng)距離移動(dòng)，但不能阻止細(xì)胞-細(xì)胞之間的病毒移動(dòng)。干旱和PMTV感染能夠上調(diào)NbHIPP26基因表達(dá)，而PMTV感染則可以保護(hù)煙草免受干旱脅迫[12]。冬麥(HordeumvulgareL.cv.Trixi)HvFP1蛋白含有HMA結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)和異戊二烯化基序，定位于細(xì)胞核。干旱脅迫、ABA處理及葉片衰老能夠誘導(dǎo)HvFP1基因表達(dá)[13]。擬南芥HIPP26的表達(dá)受冷脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫誘導(dǎo)。定位于細(xì)胞核的HIPP26蛋白能夠與鋅指同源域轉(zhuǎn)錄因子ATHB29互作，后者在脫水脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用；重金屬結(jié)合基序M/L/IXCXXC的兩個(gè)半胱氨酸在這種互作中至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄因子ATHB29也可以與擬南芥HIPP20、HIPP21、HIPP23、HIPP24、HIPP27、HIPP30互作。HIPP26突變的擬南芥植株中ATHB29調(diào)控的脅迫相關(guān)靶基因的表達(dá)受抑制[3]。擬南芥HIPP3是核定位的鋅結(jié)合蛋白，含有兩個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域和4個(gè)核定位信號(hào)。ABA處理和干旱脅迫抑制HIPP3基因表達(dá)。HIPP3過(guò)量表達(dá)可以調(diào)控?cái)M南芥400多個(gè)基因表達(dá)，絕大多數(shù)基因與病原體應(yīng)答有關(guān)，尤其是水楊酸途徑的基因。此外，HIPP3過(guò)量表達(dá)也可以影響非生物脅迫應(yīng)答基因及種子和花發(fā)育基因。HIPP3過(guò)量表達(dá)植株開(kāi)花延遲[14]。小麥TaHIPP1基因在莖和葉中表達(dá)量較高，且葉中的表達(dá)量受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)。在施用ABA和創(chuàng)傷條件下，TaHIPP1基因的表達(dá)量上調(diào)[10]。

此外，HIPPs蛋白也可能參與重金屬穩(wěn)態(tài)及解毒機(jī)制。Tehseen等的研究指出，擬南芥HIPP20、HIPP22、HIPP26和HIPP27蛋白都可以提高酵母ycf1突變體細(xì)胞的鎘耐受性。擬南芥hipp20/21/22突變植株對(duì)鎘敏感，地上部和根中鎘的積累量低于野生型，由此推測(cè)此類蛋白通過(guò)結(jié)合鎘參與鎘解毒過(guò)程[4]。擬南芥CdI19基因轉(zhuǎn)化酵母后可以明顯增加細(xì)胞對(duì)鎘脅迫的耐受性。CdI19蛋白含有兩個(gè)重金屬結(jié)合基序M/LXCXXC，羧基末端有保守的異戊二烯化位點(diǎn)。CdI19的轉(zhuǎn)錄可以被鎘誘導(dǎo)，同時(shí)也可以被Hg2+、Fe2+和Cu2+誘導(dǎo)。過(guò)量表達(dá)CdI19的擬南芥植株鎘耐受性增加[8]。在酵母(Schizosaccharomycespombe)中過(guò)量表達(dá)小麥TaHIPP1基因顯著增加了細(xì)胞在銅脅迫(100 μmol·L-1CuSO4)和高鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)率[10]。Tehseen等在研究擬南芥HIPPs蛋白和HPPs蛋白(包括已經(jīng)鑒定的擬南芥銅伴侶蛋白AtATX1、AtCCH和AtCCS)時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白均含有1個(gè)或2個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域，HMA結(jié)構(gòu)域保守的氨基酸序列可以形成βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)[4]。一部分?jǐn)M南芥HIPPs蛋白的HMA結(jié)構(gòu)域含有保守的MXCXXC基序，而此基序也是銅伴侶蛋白AtATX1、AtCCH和AtCCS共有的一致序列[15～17]，在結(jié)合銅及維持銅穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。目前關(guān)于HIPPs蛋白與植物維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)的相關(guān)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

楊樹(shù)是重要的造林和用材樹(shù)種，且已經(jīng)成為林木分子生物學(xué)研究的模式植物[19～20]。小黑楊(P.simonii×P.nigra)是小葉楊(PopulussimoniiCarr.)與歐洲黑楊(PopulusnigraL.)的雜交種，生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐貧瘠及耐鹽堿等生物學(xué)特性，在我國(guó)北方廣泛種植[21]。本研究利用生物信息學(xué)方法在毛果楊基因組中搜索鑒定了14個(gè)含有兩個(gè)重金屬結(jié)合基序MXCXXC的PtHIPPs基因家族成員，并分析了這些PtHIPPs的基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的基序組成；鑒定了毛果楊PtHIPPs和小黑楊PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性，同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了PnHIPPs基因應(yīng)答銅脅迫的表達(dá)模式。本研究可以為初步闡明楊樹(shù)HIPPs蛋白在維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮的作用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 毛果楊HIPP蛋白家族成員的鑒定

從phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)[23]網(wǎng)站下載毛果楊的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HMA)的HMM文件。利用HMMER(v 3.0)軟件中的hmmer搜索命令，以HMA.hmm文件搜索楊樹(shù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，以含有MXCXXC基序的重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域的毛果楊PtATX1(POPTR_0008s02430)蛋白序列為探針，對(duì)毛果楊蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線BlastP搜索。參數(shù)設(shè)置為：Target type=Proteome，Program=BLASTP-protein query to protein db，Expect(E) threshold=-5，其他參數(shù)默認(rèn)。進(jìn)一步篩選通過(guò)以上兩種方法獲得的蛋白質(zhì)序列，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白質(zhì)的氨基端(N端)含有2個(gè)MXCXXC保守基序，N端可以形成βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)(利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))，蛋白質(zhì)C端含有CaaX異戊二烯化位點(diǎn)。篩選鑒定后最終獲得了14個(gè)符合上述特征的毛果楊PtHIPPs蛋白。

1.2 PtHIPPs蛋白的理化性質(zhì)分析

根據(jù)篩選結(jié)果從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載毛果楊PtHIPPs蛋白的氨基酸序列。利用在線程序ExPASy(http://www.expasy.org/)分析PtHIPPs蛋白的相關(guān)特征，包括氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)和總平均親水性等。利用WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)軟件預(yù)測(cè)PtHIPPs蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3 外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和保守基序分析

下載毛果楊PtHIPPs的基因組序列及CDS序列，利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)軟件鑒定PtHIPPs基因外顯子和內(nèi)含子的分布模式。進(jìn)行PtHIPPs蛋白保守基序分析時(shí)使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)軟件，參數(shù)設(shè)置為：maximum number of different motifs to find=10，minimum width=6，maximum width=50。

1.4 HIPPs蛋白的同源序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

利用BioEdit軟件比對(duì)PtHIPPs蛋白的氨基酸序列，并鑒定MXCXXC重金屬結(jié)合保守基序、賴氨酸富集區(qū)、甘氨酸富集區(qū)及CaaX異戊二烯化位點(diǎn)。使用相同的方法和標(biāo)準(zhǔn)鑒定含有2個(gè)MXCXXC基序的擬南芥AtHIPPs和水稻(Oryzasativa)OsHIPPs蛋白并從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載這些蛋白的氨基酸序列。利用PtHIPPs、AtHIPPs和OsHIPPs蛋白的氨基酸序列、通過(guò)MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 毛果楊PtHIPPs基因組織表達(dá)特異性的鑒定

利用PopGenIE網(wǎng)站(http://popgenie.org)中毛果楊PtHIPPs基因在成熟葉片、幼葉、節(jié)點(diǎn)、節(jié)間和根中的表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建組織特異性表達(dá)可視圖。

1.6 植物材料及銅脅迫處理方法

小黑楊試材取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)。插條的培養(yǎng)、幼苗的截頂生根及培養(yǎng)條件參照Xu等的方法[21]。生根后的幼苗移至蛭石中，每2 d澆灌一次1/2霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液(改良后的Hoagland nutrient solution，含0.5 μmol·L-1CuSO4·5H2O)。2周后，將一部分苗用于鑒定小黑楊PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性[21]。將剩余部分苗利用不含Cu2+(缺銅處理)、含0.5 μmol·L-1Cu2+(正常銅濃度：對(duì)照組)、10 μmol·L-1Cu2+(過(guò)量銅處理)的1/2霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)小黑楊幼苗3、12、72 h。將葉片長(zhǎng)度達(dá)到2cm的第一個(gè)展開(kāi)的葉片命名為L(zhǎng)PI0(LPI：leaf plastochron index)[22]。取材方式為：分別對(duì)植株的根、莖、成熟葉片(LPI 7-9)和幼葉(LPI 0-2)進(jìn)行取材，液氮速凍后-80℃保存。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.7 RNA的提取及qRT-PCR分析

利用pBIOZOL植物總RNA提取試劑盒(杭州BioFlux)提取試材總RNA。去除基因組DNA后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。根據(jù)PtHIPPs基因序列設(shè)計(jì)定量引物，以毛果楊PtUBQ7(XM_002306689.2)和PtCDC2(XM_002305968.2)基因作為內(nèi)參基因(表1)[21]。按照康為世紀(jì)的UltraSYBR Mixture(LowROX)試劑盒中20 μL反應(yīng)體系的說(shuō)明加樣，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析[24～25]，鑒定小黑楊PnHIPPs基因應(yīng)答銅脅迫處理的表達(dá)模式及PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性。

表1 用于qRT-PCR的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊HIPP蛋白家族成員的理化性質(zhì)分析

搜索鑒定后在毛果楊基因組中獲得了14個(gè)含有2個(gè)重金屬結(jié)合基序MXCXXC的PtHIPPs蛋白編碼基因，其中部分成員是同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，包括PtHIPP22.1和PtHIPP22.2，PtHIPP49.1和PtHIPP49.2，PtHIPP59.1、PtHIPP59.2、PtHIPP59.4、PtHIPP59.5、PtHIPP59.6和PtHIPP59.7，PtHIPP61.1、PtHIPP61.2和PtHIPP61.3(表2)。利用ExPASy和WoLF PSORT軟件分析了14個(gè)PtHIPPs蛋白的理化性質(zhì)，包括基因登錄號(hào)和染色體位置、氨基酸數(shù)目、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、總平均親水性(GRAVY)和亞細(xì)胞定位信息等(表2)。PtHIPPs蛋白含有的氨基酸數(shù)目為225～334個(gè)，等電點(diǎn)為5.34～9.08，既有酸性氨基酸又有堿性氨基酸。GRAVY值皆為負(fù)值，表明14個(gè)PtHIPPs蛋白都是親水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，PtHIPPs主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

2.2 毛果楊HIPP蛋白家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

14個(gè)毛果楊PtHIPPs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示，PtHIPPs蛋白的N端都可以形成保守的βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)；其中，PtHIPP22.1、PtHIPP49.1、PtHIPP49.2、PtHIPP59.1、PtHIPP59.6、PtHIPP59.7、PtHIPP61.1、PtHIPP63.1蛋白可以形成2個(gè)完整的βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)。重金屬結(jié)合基序MXCXXC均位于βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)的第一個(gè)α螺旋內(nèi)。

表2 毛果楊HIPP蛋白家族成員的相關(guān)參數(shù)

圖1 毛果楊PtHIPPs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 The predicted secondary structure of PtHIPPs in P.trichocarpa

2.3 毛果楊PtHIPPs蛋白氨基酸序列的同源性比對(duì)

利用BioEdit軟件對(duì)14個(gè)PtHIPPs蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示(圖2)，所有PtHIPPs蛋白的N端都具有2個(gè)重金屬結(jié)合基序MXCXXC，C端具有異戊二烯化位點(diǎn)CaaX；某些PtHIPPs具有賴氨酸富集區(qū)(lysine-rich region)和甘氨酸富集區(qū)(glycine-rich region)。14個(gè)PtHIPPs蛋白氨基酸序列的相似性為36.67%～100%。

2.4 HIPPs蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用相同的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)獲得了2個(gè)擬南芥AtHIPPs(AtHIPP07和AtHIPP08)和3個(gè)水稻OsHIPPs(OsHIPP28、OsHIPP29和OsHIPP33)蛋白，這些蛋白質(zhì)都含有2個(gè)MXCXXC重金屬結(jié)合基序。通過(guò)MEGA5.0軟件，利用5個(gè)PtHIPPs(去除同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本)、2個(gè)AtHIPPs和3個(gè)OsHIPPs構(gòu)建同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明(圖3)，10個(gè)HIPPs蛋白被歸為3個(gè)亞組，亞組Ⅰ包含PtHIPP49、PtHIPP59、AtHIPP07、OsHIPP28及OsHIPP29，PtHIPP49、PtHIPP59與AtHIPP07的親緣關(guān)系較近；亞組Ⅱ包含PtHIPP22、PtHIPP61和OsHIPP33；亞組Ⅲ包含PtHIPP63和AtHIPP08。

圖2 PtHIPPs蛋白氨基酸序列的同源性比較 紅框表示保守的MXCXXC金屬結(jié)合基序和CaaX異戊二烯化位點(diǎn)；綠框表示賴氨酸富集區(qū)和甘氨酸富集區(qū)；點(diǎn)(·)表示相同的氨基酸；連接號(hào)(-)是為了進(jìn)行同源性比對(duì)加入的空格。Fig.2 Homologous comparison of the amino acid sequences of PtHIPPs Red boxes indicate the conserved MXCXXC metal-binding motif and CaaX isoprenylation site, and the green boxes indicate the lysine-rich region and glycine-rich region. Dots indicate the identical amino acids, and dashes indicate gaps introduced to optimize the alignment.

圖3 毛果楊、擬南芥和水稻HIPPs蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HIPP proteins from P.trichocarpa,A.thaliana and O.sativa

2.5 PtHIPPs外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的保守基序分析

PtHIPPs基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示(圖4B)，5個(gè)PtHIPPs基因具有相同的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，均含有3個(gè)內(nèi)含子，但是內(nèi)含子和外顯子的長(zhǎng)度存在差異。利用MEME軟件在PtHIPPs蛋白序列中共預(yù)測(cè)了十個(gè)保守基序(命名為motif 1～10)(表3，圖4C)。PtHIPPs蛋白都包含基序1、2、3、4和基序5，且這5個(gè)基序在每個(gè)PtHIPPs蛋白中的排列順序相同；基序1和基序3中分別包含一個(gè)重金屬結(jié)合基序MXCXXC。同一亞組中的PtHIPPs蛋白通常含有相似的基序組成，且基序的排列順序也相同；不同亞組的PtHIPPs蛋白之間基序組成存在差異。基序6僅存在于SI亞組成員中；SII亞組蛋白含有8～9個(gè)基序，且基序7和基序10僅存在于SII亞組蛋白中。SIII與SII成員中基序9的位置存在明顯差異。預(yù)測(cè)的這些基序在PtHIPPs蛋白中的相關(guān)功能還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.6 PtHIPPs和PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性

利用PopGenIE網(wǎng)站中毛果楊PtHIPPs基因在成熟葉片、幼葉、節(jié)點(diǎn)、節(jié)間和根中的表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建的組織特異性表達(dá)可視圖顯示，PtHIPP22.1和PtHIPP63.1基因在成熟葉片中表達(dá)量較高，PtHIPP61.1基因在幼葉中大量表達(dá)；PtHIPP49.1在節(jié)間的表達(dá)量較高；PtHIPP59.1、PtHIPP59.4、PtHIPP59.6和PtHIPP59.7基因具有相同的組織特異性表達(dá)模式，均在節(jié)點(diǎn)大量表達(dá)(圖5:A～H)。

圖4 PtHIPPs基因結(jié)構(gòu)及蛋白基序分析 A. PtHIPPs蛋白的進(jìn)化分析；B. PtHIPPs基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(黃色表示CDSs；藍(lán)色表示上游/下游序列；黑線表示內(nèi)含子)；C. PtHIPPs蛋白的保守基序分析Fig.4 Gene structure of PtHIPPs and the motif analysis of PtHIPPs A. Phylogenetic analysis of PtHIPPs proteins; B. The exons/introns structure of PtHIPPs genes(Yellow indicates CDSs,blue indicates upstream/downstream sequences,and black line indicates introns); C. Conservation motifs analysis of PtHIPPs proteins

表3 毛果楊PtHIPPs蛋白的基序序列

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)鑒定小黑楊PnHIPPs基因在根、莖、幼葉和成熟葉片中的組織表達(dá)特異性。PtHIPP22.1和PtHIPP22.2、PtHIPP49.1和PtHIPP49.2、PtHIPP59.1和PtHIPP59.2是毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中描述的同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，且分別具有高度同源的核苷酸序列，因此，沒(méi)有設(shè)計(jì)PtHIPP22.2、PtHIPP49.2和PtHIPP59.2的定量引物；PtHIPP61.1、PtHIPP61.2和PtHIPP61.3基因也存在此類情況。此外，利用設(shè)計(jì)的PtHIPP59.5定量引物進(jìn)行qRT-PCR時(shí)未獲得擴(kuò)增結(jié)果。所以表1中不包括PtHIPP22.2、PtHIPP49.2、PtHIPP59.2、PtHIPP59.5、PtHIPP61.2和PtHIPP61.3基因的定量引物。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖5:A～H中柱形圖)，PnHIPP63.1在小黑楊根、莖、幼葉和成熟葉片中大量表達(dá)，表達(dá)水平無(wú)明顯差異。PnHIPP22.1和PnHIPP61.1在檢測(cè)的各組織部位均表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最高。PnHIPP49.1、PnHIPP59.1、PnHIPP59.4、PnHIPP59.6和PnHIPP59.7基因在莖中的表達(dá)量較高。由此可見(jiàn)，毛果楊PtHIPPs和小黑楊PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性存在一定差異。

圖5 PtHIPPs和PnHIPPs基因的組織表達(dá)特異性 毛果楊PtHIPPs基因的組織特異性表達(dá)可視圖數(shù)據(jù)來(lái)自http://PlantGenIE.org[26]。柱形圖為小黑楊中相應(yīng)的PnHIPPs基因在幼葉(young leaves，YL)、成熟葉片(mature leaves，ML)、莖(stems，S)和根(roots，R)中的組織特異性表達(dá)模式，不同的字母代表鄧肯檢驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P<0.05)。Fig.5 Tissue-specific expression characterization of PtHIPPs and PnHIPPs genes The tissue-specific expression visual images of PtHIPPs genes in P.trichocarpa were generated using the data derived from http://PlantGenIE.org[26]. The bar graphs indicated the tissue-specific expression profiles which generated using the expression data of PnHIPPs genes in young leaves(YL),mature leaves(ML),stems(S),and roots(R) of P.simonii×P.nigra detected by qRT-PCR. The different letters represent statistical significant differences(P<0.05) using Duncan’s test.

圖6 銅脅迫條件下小黑楊不同組織中PnHIPPs基因的表達(dá)模式 A、C、E、G圖為缺銅處理?xiàng)l件下幼葉、成熟葉片、莖、根中PnHIPPs基因的表達(dá)熱圖；B、D、F、H圖為過(guò)量銅處理?xiàng)l件下這些組織中PnHIPPs基因的表達(dá)熱圖。圖中黑色箭頭所示依次為幼葉、成熟葉片、莖和根。熱圖左側(cè)為基因名稱，頂部標(biāo)注為處理時(shí)間及銅離子濃度。用2-ΔΔCT法分析銅脅迫條件下不同組織中PnHIPPs的表達(dá)量。利用log2(樣品/對(duì)照)值表示不同銅脅迫條件處理不同時(shí)間后每個(gè)PnHIPP基因的相對(duì)表達(dá)量。熱圖的右下角為標(biāo)尺，熱圖中不同的顏色塊表示處理后基因的表達(dá)量與對(duì)照相比上升或下降。Fig.6 Expression profiles of PnHIPPs genes in different tissues of P.simonii×P.nigra under copper stress conditionsA,C,E and G are heatmaps of PnHIPPs genes in young leaves,mature leaves,stems and roots under copper deficiency condition,and figures B,D,F and H are heatmaps of these genes in the tissues under excess copper treatment. The black arrows in the figure indicate the tissues of young leaves,mature leaves,stems,and roots in turn. In the heatmaps,the genes are shown on the left,and the copper stress concentrations and treatment times are indicated on the top. The 2-ΔΔCT method was used to analyze the expression levels of PnHIPPs in different tissues under copper stress conditions. The values of log2(sample/control) upon to copper stress conditions and different treated times were calculated as the relative expression levels of every PnHIPP gene. Scale bars are on the bottom right,and the different color of the cells in the heatmaps indicated the expression level of the genes went up or down compared with their controls after treatments.

2.7 銅脅迫條件下小黑楊PnHIPPs基因的表達(dá)模式分析

通過(guò)qRT-PCR鑒定PnHIPPs基因應(yīng)答銅缺乏(0 μmol·L-1Cu2+)和銅過(guò)量(10 μmol·L-1Cu2+)脅迫條件的表達(dá)模式。結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照(0.5 μmol·L-1Cu2+)處理相比，不同組織中PnHIPPs基因應(yīng)答銅缺乏和銅過(guò)量脅迫的表達(dá)模式存在差異。根中，除了PnHIPP49.1基因在缺銅處理72 h后表達(dá)量低于對(duì)照、PnHIPP59.6基因在缺銅處理12 h后表達(dá)量與對(duì)照無(wú)差異、PnHIPP49.1在過(guò)量銅處理3 h后表達(dá)水平與對(duì)照無(wú)差異之外，其他PnHIPPs基因在缺銅、過(guò)量銅處理不同時(shí)間后表達(dá)量均高于對(duì)照。莖中，除了PnHIPP59.7基因在缺銅處理12 h、PnHIPP61.1在缺銅處理3 h、PnHIPP59.7在過(guò)量銅處理3 h后表達(dá)水平分別高于對(duì)照之外，其他基因在缺銅、過(guò)量銅分別處理不同時(shí)間后表達(dá)量均低于對(duì)照。幼葉中，缺銅、過(guò)量銅處理3、12、72 h后8個(gè)PnHIPPs基因的表達(dá)量均低于對(duì)照。

成熟葉片中，PnHIPP22.1、PnHIPP59.1、PnHIPP59.6、PnHIPP61.1和PnHIPP63.1基因的表達(dá)量在缺銅處理3和12 h后低于對(duì)照，而PnHIPP49.1、PnHIPP59.4和PnHIPP59.7基因在缺銅處理12和72 h后表達(dá)量高于對(duì)照。PnHIPP22.1、PnHIPP59.6和PnHIPP61.1基因的表達(dá)量在過(guò)量銅處理3 h后高于對(duì)照，處理12 h后表達(dá)量低于對(duì)照；PnHIPP22.1和PnHIPP61.1基因在過(guò)量銅處理72 h后表達(dá)量又高于對(duì)照。PnHIPP49.1、PnHIPP59.4和PnHIPP59.7基因的表達(dá)水平在過(guò)量銅處理后均高于對(duì)照。

3 討論

植物重金屬耐受性是重金屬吸收和分配的綜合調(diào)控結(jié)果，金屬伴侶蛋白是金屬離子在細(xì)胞內(nèi)安全傳輸、維持細(xì)胞內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。HIPP類蛋白是維管植物特有的在重金屬穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用的伴侶蛋白。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，擬南芥、水稻、毛果楊和粟米的HIPP蛋白家族成員分為5個(gè)類別，本研究鑒定的14個(gè)含有2個(gè)重金屬結(jié)合基序的PtHIPPs也包含其中，并采用相同的蛋白編號(hào)；de Abreu-Neto等推測(cè)包括HPPs和HIPPs在內(nèi)的植物金屬伴侶基因在植物進(jìn)化的早期即已進(jìn)行多樣化分化，這種多樣化主要發(fā)生在維管植物的祖先世系中，且這種高度分化的特性與此類基因家族在植物中的重要功能是一致的。進(jìn)化分析也表明，HPPs和HIPPs基因在陸地植物進(jìn)化過(guò)程中也存在基因復(fù)制和功能分化等現(xiàn)象[5]。HIPP類蛋白具有一個(gè)或兩個(gè)保守的重金屬結(jié)合基序和C端的異戊二烯化位點(diǎn)；已有的研究顯示此類蛋白在不同植物物種中具有較多的家族成員[9]。目前認(rèn)為，HIPPs蛋白可能與(1)重金屬穩(wěn)態(tài)及解毒機(jī)制相關(guān)，如鎘耐受性；(2)與應(yīng)答其他非生物脅迫相關(guān)，如ABA處理、寒冷或干旱；(3)與植物和病原菌的互作相關(guān)[5,13～14]。

HIPPs蛋白的重金屬結(jié)合基序M/L/IXCXXC可以通過(guò)形成半胱氨酰硫配體結(jié)合重金屬，參與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和金屬穩(wěn)態(tài)[9,27]。應(yīng)答鎘脅迫的擬南芥CdI19蛋白定位于細(xì)胞膜，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)后可以直接通過(guò)其CXXC基序與鎘互作，由此推測(cè)CdI19蛋白可能作為重金屬進(jìn)入細(xì)胞的最初屏障在細(xì)胞的重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[8]。Dykema等的鑒定結(jié)果顯示，擬南芥HIPP蛋白ATFP3可以通過(guò)MXCXXC基序與Cu2+、Ni2+和Zn2+結(jié)合[9]。研究表明，擬南芥的銅伴侶蛋白AtATX1、AtCCH和AtCCS的銅結(jié)合基序也是MXCXXC，這些蛋白在細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。擬南芥AtATX1屬于HPP類蛋白，N端可以形成典型的βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)，C端不含CaaX基序[4,15]。AtATX1蛋白在細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，銅結(jié)合基序MXCXXC是AtATX1應(yīng)答銅脅迫所必須的。生長(zhǎng)在銅過(guò)量土壤中的過(guò)量表達(dá)AtATX1的擬南芥植株具有較高的銅耐受性，將MXCXXC突變成MXGXXG后，過(guò)量表達(dá)AtATX1的轉(zhuǎn)基因株系與野生型的銅敏感性相同[18]。此外，與擬南芥AtATX1同源的酵母ScAtx1也具有銅結(jié)合基序MXCXXC且可以形成βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)。ScAtx1能夠?qū)⒁粋€(gè)Cu+傳遞給CCC2蛋白；ScAtx1的賴氨酸富集區(qū)與CCC2蛋白的酸性氨基酸之間的靜電引力可以實(shí)現(xiàn)這兩種蛋白的互作[29～30]。人Atx1蛋白HAH1(Atox1)具有運(yùn)輸銅和抗氧化損傷功能，HAH1蛋白保守的賴氨酸突變后可以消除其抗氧化功能[31]。本研究鑒定的14個(gè)毛果楊PtHIPPs基因(包括同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本)編碼的PtHIPPs蛋白都含有兩個(gè)MXCXXC重金屬結(jié)合基序；8個(gè)PtHIPPs的N端可以形成2個(gè)完整的βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)；PtHIPPs蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，13個(gè)PtHIPPs蛋白具有賴氨酸富集區(qū)(圖2)；這些特征是銅伴侶蛋白ATX1具備的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，由此推測(cè)，篩選到的毛果楊PtHIPPs蛋白有可能與維持楊樹(shù)細(xì)胞的銅穩(wěn)態(tài)相關(guān)。

異戊二烯化是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方式，是通過(guò)酶促反應(yīng)將聚異戊二烯基團(tuán)以硫醚鍵連接到多肽鏈C端CaaX的半胱氨酸上，此蛋白可以進(jìn)行進(jìn)一步修飾，包括切除aaX三個(gè)氨基酸殘基或半胱氨酸羧基端甲基化。異戊二烯化可以促進(jìn)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)或與膜的特異性相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織或細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程[7]。目前的研究表明，植物中某些具有異戊二烯化位點(diǎn)的HIPPs蛋白定位于細(xì)胞核，進(jìn)而行使各種生理功能。冬麥HvFP1蛋白定位于細(xì)胞核，其表達(dá)受干旱和ABA誘導(dǎo)[13]。煙草NbHIPP26是非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中質(zhì)膜-細(xì)胞核的信號(hào)分子，未脂化的NbHIPP26主要定位于細(xì)胞核，可以激活干旱脅迫應(yīng)答，并促進(jìn)PMTV病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)輸[12]。擬南芥HIPP26蛋白在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子ATHB29互作進(jìn)而應(yīng)答脫水脅迫；HIPP26的M/L/IXCXXC基序的兩個(gè)C在這種互作中至關(guān)重要[3]。擬南芥核定位的鋅結(jié)合蛋白HIPP3含有兩個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域，此蛋白可能通過(guò)結(jié)合鋅作為應(yīng)答病原體侵染的水楊酸依賴途徑的上游調(diào)控因子，同時(shí)也與非生物脅迫應(yīng)答、種子和花發(fā)育相關(guān)[14]。此外，小麥核定位的TaHIPP1蛋白在酵母中過(guò)量表達(dá)明顯增加了細(xì)胞在銅脅迫條件下的生長(zhǎng)率[10]。大豆GmHMADP基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白質(zhì)具有2個(gè)MXCXXC金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞核，此蛋白無(wú)異戊二烯化位點(diǎn)。GmHMADP的表達(dá)量受Cu2+、Cd2+誘導(dǎo)上調(diào)。GmHMADP過(guò)表達(dá)擬南芥植株在Cu、Cd脅迫后根長(zhǎng)和干重均顯著高于野生型植株[32]。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，本研究鑒定的具有2個(gè)MXCXXC位點(diǎn)的毛果楊PtHIPPs蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的可能性較大。14個(gè)PtHIPPs蛋白可以分為3個(gè)亞組，這些蛋白的編碼基因具有相同的基因結(jié)構(gòu)，均含有3個(gè)內(nèi)含子；此外，同一亞組內(nèi)的PtHIPPs蛋白具有相同的基序組成且基序的排列順序相同(圖3)；由此推測(cè)，同一亞組內(nèi)的PtHIPPs蛋白可能具有相同或相似功能，且不同亞組之間的PtHIPPs蛋白可能存在功能差異。

表達(dá)數(shù)據(jù)分析及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PtHIPPs和PnHIPPs基因的組織特異性表達(dá)特性存在差異。大多數(shù)PtHIPPs和PnHIPPs基因在節(jié)(莖)中大量表達(dá)，PtHIPPs基因在根中的表達(dá)量較低；除了PnHIPP63.1，其他PnHIPPs基因在成熟葉片和幼葉中的表達(dá)量都較低(圖5)。PtHIPPs和PnHIPPs基因之間組織特異性表達(dá)模式的差異有可能是毛果楊和小黑楊之間的物種差異導(dǎo)致的。此外，定量鑒定數(shù)據(jù)表明，銅缺乏和銅過(guò)量脅迫條件都可以導(dǎo)致PnHIPPs基因在小黑楊不同組織中的表達(dá)模式發(fā)生改變(圖6)。例如，缺銅和銅過(guò)量處理后幼葉PnHIPPs基因的表達(dá)模式相似，均低于對(duì)照。除了PnHIPP59.7和PnHIPP61.1基因，莖中其他基因在缺銅、過(guò)量銅處理不同時(shí)間后表達(dá)量均低于對(duì)照。根中大多數(shù)PnHIPPs基因的表達(dá)量在兩種銅脅迫處理后普遍高于對(duì)照(PnHIPP49.1基因缺銅處理72 h后表達(dá)量低于對(duì)照)。成熟葉片中，PnHIPP49.1、PnHIPP59.4和PnHIPP59.7基因在缺銅和銅過(guò)量處理12、72 h后表達(dá)量均高于對(duì)照。

因此，根據(jù)重金屬結(jié)合基序、異戊二烯化位點(diǎn)、賴氨酸富集區(qū)等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果、PtHIPPs和PnHIPPs基因的組織特異性表達(dá)特點(diǎn)、銅脅迫條件下PnHIPPs基因在小黑楊不同組織中的表達(dá)模式推測(cè)，HIPP蛋白家族成員可能在楊樹(shù)的不同組織中參與結(jié)合銅及維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)的復(fù)雜過(guò)程，但其功能的共性及特異性尚需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。