白 潔

(西華大學(xué)，成都 610039)

牡蠣(Oyster)屬軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科動(dòng)物，是一種藥食同源、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的水產(chǎn)品，素有“海中牛奶”之稱[1]。其中，太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的產(chǎn)量約占總牡蠣產(chǎn)量的1/3，其蛋白質(zhì)、必需氨基酸含量高，口味鮮美，具有較高的利用價(jià)值[2]。

隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們生活水平的提高，高值化水產(chǎn)品的需求量大幅上升，水解蛋白產(chǎn)品則為其中最受歡迎的一種。蛋白質(zhì)被水解后變成小分子肽，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值變高，功能性質(zhì)也有所提升，被越來(lái)越多的研究者所青睞。豆類(lèi)蛋白質(zhì)、魚(yú)肉蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物均得到廣泛的研究，也有新的功效被發(fā)掘出來(lái)，如降血壓、降血糖、增強(qiáng)免疫力[3,4]。而牡蠣水解蛋白的研究則較為少見(jiàn)[5,6]。目前蛋白質(zhì)水解的方法是加入商業(yè)用酶，例如木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶，而酶的成本較高，這對(duì)實(shí)際生產(chǎn)造成了一定影響，我們考慮用微生物發(fā)酵牡蠣來(lái)制備牡蠣水解蛋白，發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可用來(lái)制備新型調(diào)味液，豐富牡蠣的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮太平洋牡蠣：購(gòu)自成都市某水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，于2 h內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；干酪乳桿菌(L．casei)：編號(hào)GIM1.190，購(gòu)于CICC；MRS培養(yǎng)基：英國(guó)Oxoid公司；其他化學(xué)試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-PB80Easy210型破壁機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司；2300 自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士FOSS 公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；PHS-3E型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；桑普特電氣兩用殺菌鍋 諸城市金鼎食品機(jī)械有限公司。

1.3 牡蠣勻漿液培養(yǎng)基的制備

將牡蠣清洗干凈，取牡蠣肉，稱重，加入同樣質(zhì)量的蒸餾水，放進(jìn)破壁機(jī)中勻漿2 min。測(cè)定勻漿液的蛋白質(zhì)含量[7]，加入5%(質(zhì)量比)蔗糖，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的活性炭脫腥脫色30 min，用蒸餾水稀釋至蛋白質(zhì)含量為10%(質(zhì)量比)，并且調(diào)節(jié)pH至7.0，置于500 mL錐形瓶中，于105 ℃滅菌20 min，冷卻，備用。

1.4 干酪乳桿菌發(fā)酵

將用MRS培養(yǎng)基活化過(guò)的干酪乳桿菌再次接種至MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，制成種子液，該種子液的濃度為106CFU/mL。將種子液接種到1.3方法制備的牡蠣勻漿液培養(yǎng)基中，接種量為8%，裝液量為30%，150 r/min的速度，在36 ℃的溫度下振蕩培養(yǎng)，在不同時(shí)間(0，1，2，3，4，5 d)取樣，在95 ℃水浴中煮沸15 min以滅酶，8000 r/min離心15 min，取上清液，則為牡蠣發(fā)酵液。

1.5 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

以GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》為參考，測(cè)定牡蠣勻漿液培養(yǎng)基和牡蠣發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量，用下式計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

1.6 ?；撬岷康臏y(cè)定[8]

參照GB/T 5009.169-2003中的高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.7 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定[9]

采用甲醛電位滴定法。

1.8 揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)的測(cè)定

采用康衛(wèi)氏皿擴(kuò)散法。

1.9 氨基酸組成的測(cè)定[10]

稱取一定量牡蠣勻漿液培養(yǎng)基、牡蠣發(fā)酵液，加入6 mol/L HCl(含有1%苯酚)，在105 ℃水解24 h，定容，成水解液。吸取20 mL上述水解液真空干燥，樣品衍生，再次進(jìn)行干燥。將樣品稀釋液與干燥樣品混合溶解，以8000 r/min的轉(zhuǎn)速、4 ℃的溫度離心15 min，高效液相分析。色譜柱：PICO-TAG柱，長(zhǎng)度150 mm；流動(dòng)相A：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 6.5)；流動(dòng)相B：60%乙腈溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL/min。

1.10 牡蠣發(fā)酵調(diào)味液的制備及感官評(píng)價(jià)

按照1.4方法制備好的牡蠣發(fā)酵液加入0.1%(W/V)的高甲氧基果膠作為穩(wěn)定劑，再加入0.2%(W/V)的甜味劑，灌裝，冷卻，制備成牡蠣發(fā)酵調(diào)味液。在4 ℃靜置24 h后對(duì)牡蠣發(fā)酵調(diào)味液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.11 牡蠣發(fā)酵調(diào)味液體外ACE抑制活性測(cè)定[11]

采用HPLC法測(cè)定體外ACE抑制活性，將50 μL牡蠣發(fā)酵調(diào)味液與等量ACE酶液(25 mU)混合，加入80 μL濃度為2.5 mmol/L的馬尿酸-組氨酰-亮氨酸-硼酸緩沖液，在37 ℃反應(yīng)60 min，加入250 μL 1 mol/L的HCl將反應(yīng)終止，過(guò)膜，HPLC進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為超純水(0.08% TFA)；流動(dòng)相B為100%乙腈(0.08% TFA)；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。

1.12 數(shù)據(jù)分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0、Origin 8.1進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)回收率

測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間牡蠣發(fā)酵液的蛋白質(zhì)回收率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)回收率和?；撬岷侩S發(fā)酵時(shí)間的變化

發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響比較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)回收率先急劇增加后緩慢增加，從第0天時(shí)的44.7%增加到第5天時(shí)的91.5%，實(shí)際上，第4天時(shí)的蛋白質(zhì)回收率為88.3%，已接近第5天的最大值，二者無(wú)顯著性差異(p>0.05)。接種的干酪乳桿菌能夠很好地利用蛋白質(zhì)，可將不溶性大分子蛋白有效降解成可溶性小分子蛋白，故可增大蛋白質(zhì)回收率[12]。較高的蛋白質(zhì)回收率證明用干酪乳桿菌發(fā)酵牡蠣勻漿液來(lái)制備牡蠣水解液，進(jìn)而制備牡蠣發(fā)酵調(diào)味液的可行性。

2.2 牛磺酸含量

牡蠣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)獨(dú)特之處在于它的?；撬岷繕O高，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間牡蠣發(fā)酵液的?；撬岷?，結(jié)果見(jiàn)圖1。未發(fā)酵的牡蠣勻漿液?；撬岷繛?80 mg/dL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，?；撬岷肯却蠓黾雍筅呌谄椒€(wěn)，最高達(dá)到586 mg/dL。發(fā)酵過(guò)程并沒(méi)有使?；撬岷拷档?，反而升高了其含量，這可能歸功于干酪乳桿菌所產(chǎn)生的各種酶的作用。

2.3 氨基酸態(tài)氮含量

測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間牡蠣發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 氨基酸態(tài)氮含量和TVBN隨發(fā)酵時(shí)間的變化

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸態(tài)氮含量明顯增加，在發(fā)酵后期達(dá)到平穩(wěn)，在第5天時(shí)達(dá)到0.98 mg/100 g。牡蠣中的蛋白質(zhì)含量較高，在干酪乳桿菌的作用下，大分子蛋白質(zhì)被分解為小分子肽或游離氨基酸，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，干酪乳桿菌產(chǎn)生的蛋白酶越多，被酶分解出的游離氨基酸越多，故氨基酸態(tài)氮含量也越多，這有助于腸道對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，牡蠣發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅提高[13]。

2.4 TVBN

牡蠣作為一種濾食性海洋生物，身上有很多微生物，這些微生物會(huì)引起牡蠣品質(zhì)變化。揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)是由于酶和細(xì)菌的作用，使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨、三甲胺、甲胺等堿性含氮物質(zhì)，會(huì)使牡蠣腐敗。由圖2還可知，未發(fā)酵的牡蠣勻漿液的TVBN含量較低，為37.7 mg/100 g，而經(jīng)過(guò)發(fā)酵的牡蠣發(fā)酵液的TVBN含量有所上升，尤其在第5天明顯上升。TVBN含量的上升是因?yàn)榧尤氲母衫胰闂U菌所致，其使大分子蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生很多游離氨基態(tài)氮，這其中就有氨、三甲胺、甲胺等物質(zhì)，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，這些物質(zhì)累積越多。鑒于TVBN含量過(guò)高對(duì)感官、品質(zhì)等方面均會(huì)產(chǎn)生不良影響，制作牡蠣發(fā)酵調(diào)味液時(shí)，發(fā)酵時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，要綜合考慮。

2.5 氨基酸組成

測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間牡蠣發(fā)酵液的氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 氨基酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

由表1可知，牡蠣發(fā)酵液的氨基酸組成非常完善，必需氨基酸含量高，所占比例在42.7%～43.1%之間，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。并且嬰兒必需的精氨酸含量也相當(dāng)高，所占比例在22.1%～23.6%之間，符合嬰兒的營(yíng)養(yǎng)需求?？偘被岷坑傻?天的91.46 mg/dL上升到第4天的最高值97.89 mg/dL，而第5天含量有所下降，為97.45 mg/dL。在所測(cè)試的17種氨基酸中，除了組氨酸、丙氨酸外，其余氨基酸沒(méi)有明顯下降，基本都呈上升趨勢(shì)[14]。干酪乳桿菌發(fā)酵牡蠣使牡蠣蛋白質(zhì)更易被吸收，除此之外，特定的氨基酸還可能起到更多的健康作用，例如抗氧化、抗高血壓、抑制ACE、增強(qiáng)免疫力等，起到了營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的作用。

2.6 牡蠣發(fā)酵調(diào)味液感官評(píng)價(jià)

不同發(fā)酵時(shí)間制作的牡蠣發(fā)酵調(diào)味液的感官評(píng)分見(jiàn)表2。

表2 牡蠣發(fā)酵調(diào)味液感官評(píng)價(jià)

由表2可知，未經(jīng)發(fā)酵(0 d)制作的調(diào)味液的總評(píng)分較低，有較重的牡蠣腥味，嘗起來(lái)酸澀，顏色較黃，略有沉淀。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，牡蠣發(fā)酵調(diào)味液的總評(píng)分有很大提高，但是發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，評(píng)分又略有下降。發(fā)酵1，2，3，4 d制作的牡蠣發(fā)酵調(diào)味液風(fēng)味獨(dú)特，有清香的牡蠣味，沒(méi)有腥味，爽口，酸度適宜，呈象牙白色，組織均勻、無(wú)沉淀。發(fā)酵5 d制作的牡蠣發(fā)酵調(diào)味液缺乏牡蠣香味，反而有酸臭味，后味較重，酸味偏重，呈黃色，略有沉淀，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)度，較高的TVBN引起輕微腐敗，導(dǎo)致感官品質(zhì)下降[15]。故實(shí)際生產(chǎn)中可以采用發(fā)酵4 d。

2.7 牡蠣發(fā)酵調(diào)味液體外ACE抑制活性

測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間牡蠣發(fā)酵液制成的牡蠣發(fā)酵調(diào)味液的體外ACE抑制活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 ACE抑制能力隨發(fā)酵時(shí)間的變化

未發(fā)酵的牡蠣勻漿液本身就具有較高的ACE抑制活性(47.5%)，經(jīng)過(guò)1 d干酪乳桿菌的發(fā)酵，牡蠣發(fā)酵調(diào)味液體外ACE抑制活性急劇增大，然后緩慢增加至平穩(wěn)，在第5天達(dá)到最大值83.6%?？梢?jiàn)發(fā)酵前后兩者的體外ACE抑制活性有顯著差異，可能是在干酪乳桿菌所產(chǎn)的蛋白酶等酶類(lèi)的作用下，蛋白質(zhì)分解成特定肽段或氨基酸，這些肽段或氨基酸與ACE活性區(qū)域親和力較強(qiáng)，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，可能產(chǎn)生降血壓的良好效果。有研究表明[16]，含有較高含量的疏水氨基酸(如纈氨酸、異亮氨酸)支鏈時(shí)，ACE抑制活性較強(qiáng)，上述結(jié)果表明，發(fā)酵后，纈氨酸、異亮氨酸含量有所增加，這可能是牡蠣發(fā)酵調(diào)味液具有較好體外ACE抑制活性的主要原因。

3 結(jié)論

以太平洋牡蠣肉為原料，將干酪乳桿菌接種至牡蠣勻漿液，發(fā)酵不同時(shí)間，測(cè)定了發(fā)酵液的蛋白質(zhì)回收率、牛磺酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、TVBN含量、氨基酸組成。用發(fā)酵液進(jìn)一步制成牡蠣發(fā)酵調(diào)味液并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，測(cè)定了其體外ACE抑制活性。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，上述指標(biāo)均有所增加，其中發(fā)酵液的蛋白質(zhì)回收率高達(dá)91.5%，牛磺酸含量最高達(dá)到586 mg/dL，氨基酸態(tài)氮含量在第5天時(shí)達(dá)到0.98 mg/100 g，TVBN含量在第5天明顯上升，氨基酸含量在第4天時(shí)達(dá)到最高值97.89 mg/dL，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅提高。牡蠣發(fā)酵調(diào)味液具有較高的感官評(píng)分，尤其是發(fā)酵4 d的調(diào)味液，風(fēng)味獨(dú)特，有清香的牡蠣味，沒(méi)有腥味，爽口，酸度適宜，呈象牙白色，組織均勻，無(wú)沉淀。牡蠣發(fā)酵調(diào)味液還能明顯提高體外ACE抑制活性，ACE清除率最高可達(dá)83.6%。本研究為牡蠣高值化利用提供了理論依據(jù)，為牡蠣產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。