劉永瑞　張妍　李秀英

摘要：目的 ?調(diào)查濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶表型及其對(duì)常用抗生素的耐藥性，為臨床用藥提供依據(jù)。方法 ?收集2017年1月～7月濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)肺炎克雷伯菌97株，應(yīng)用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法進(jìn)行肺炎克雷伯菌AmpC酶表型初篩，對(duì)初篩陽(yáng)性菌用多重PCR方法檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因，分析其耐藥情況。結(jié)果 ?97株肺炎克雷伯菌中共篩選出40株對(duì)頭孢西丁不敏感菌株，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，有7株AmpC酶陽(yáng)性，檢出率為7.22%（7/97），均為DHA型。產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株僅對(duì)亞胺培南敏感（100.00%）。結(jié)論 ?濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌發(fā)生率相對(duì)較低，以DHA型基因?yàn)橹鳎委煈?yīng)首選碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物。

關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌;質(zhì)粒;AmpC酶;藥敏結(jié)果

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.99 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.039

文章編號(hào)：1006-1959（2019）19-0122-03

Klebsiella Pneumoniae AmpC Enzyme Detection and Antibiotic Selection

LIU Yong-rui，Zhang Yan，LI Xiu-ying

（Department of Respiratory，the First People's Hospital of Jining，Jining 272100，Shandong，China）

Abstract：Objective ?To investigate the AmpC phenotype of Klebsiella pneumoniae mediated by Klebsiella pneumoniae in Jining First People's Hospital and its resistance to common antibiotics， and provide evidence for clinical use.Methods ?A total of 97 strains of non-repetitive Klebsiella pneumoniae isolated from the First People's Hospital of Jining City from January to July 2017 were collected. The phenycepin diffusion method was used to screen the AmpC enzyme phenotype of Klebsiella pneumoniae. The primary screening positive bacteria were detected by multiplex PCR method for plasmid-mediated AmpC enzyme gene， and the drug resistance was analyzed.Results A total of 40 strains of cefoxitin-insensitive strains were screened from 97 strains of Klebsiella pneumoniae. Seven strains of AmpC enzyme were positive by multiplex PCR， and the detection rate was 7.22% （7/97）， all of which were DHA type. The plasmid-mediated AmpC enzyme strain was only sensitive to imipenem （100.00%）.Conclusion ?The incidence of plasmid-mediated AmpC enzyme Klebsiella pneumoniae in the First People's Hospital of Jining City is relatively low. The DHA type gene is the main treatment. The carbapenem antibiotics should be the first choice for treatment.

Key words：Klebsiella pneumoniae;Plasmid;AmpC enzyme;Drug susceptibility results

根據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)顯示，目前我國(guó)臨床分離菌株以革蘭氏陰性桿菌為主，其中腸桿菌屬中以大腸桿菌及肺炎克雷伯菌為主[1]。隨著β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的現(xiàn)象也日益嚴(yán)重。其中細(xì)菌產(chǎn)生各種水解酶是革蘭氏陰性桿菌耐藥的主要機(jī)制[2]，目前臨床上研究比較多、且對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生AmpC β-內(nèi)酰胺酶（AmpC酶），AmpC酶是由革蘭氏陰性桿菌的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶。革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)AmpC酶菌株呈現(xiàn)廣泛的耐藥。因此及時(shí)檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶對(duì)指導(dǎo)臨床抗生素的選擇具有一定意義。本研究對(duì)我院肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因型及耐藥性進(jìn)行研究，旨在為臨床合理應(yīng)用抗生素提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 ?①菌株來(lái)源：收集2017年1月～7月濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院全院住院患者臨床標(biāo)本中（包括呼吸道、血液、分泌物等）分離的無(wú)重復(fù)肺炎克雷伯菌97株。②質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC 25922為陰性質(zhì)控菌株，陰溝腸桿菌 029M為陽(yáng)性質(zhì)控菌株。

1.2試劑及儀器 ?主要試劑與儀器包括Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物檢定儀（法國(guó)生物梅里埃公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國(guó) Perkin Elmer公司）、頭孢西?。‵OX，30 μg）藥敏紙片（英國(guó)Osoid公司）、凝膠電泳儀（上海天能公司）。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 ?對(duì)臨床分離非重復(fù)菌株接種血瓊脂培養(yǎng)基，試驗(yàn)菌株應(yīng)用全自動(dòng)微生物檢定儀進(jìn)行鑒定。

1.3.2產(chǎn)AmpC酶菌株初篩 ?采用K-B紙片擴(kuò)散法初篩，以FOX（30 μg）藥敏紙片檢測(cè)分離菌株，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑≤18 mm者可疑為產(chǎn)AmpC酶菌株。

1.3.3質(zhì)粒AmpC酶基因檢測(cè) ?應(yīng)用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取初篩試驗(yàn)陽(yáng)性菌為PCR模板，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用多重PCR引物序列（上海生工合成）[3]，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系50 μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min;94℃變性35 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;72℃延伸8 min。最后所得PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，通過(guò)凝膠電泳儀觀察結(jié)果并拍照記錄。

2結(jié)果

2.1初步篩選結(jié)果 ?97株肺炎克雷伯菌中有40株對(duì)頭孢西丁中介或耐藥，為初篩產(chǎn)AmpC酶陽(yáng)性菌，檢出率為41.24%（40/97）。

2.2多重PCR結(jié)果 ?多重PCR顯示7株肺炎克雷伯菌株擴(kuò)增陽(yáng)性條帶（405 bp），判定均為DHA型，檢出率為7.22%（7/97），見(jiàn)圖1。

2.3藥敏結(jié)果 ?產(chǎn)DHA型質(zhì)粒AmpC酶的肺炎克雷伯菌對(duì)三、四代頭孢菌素耐藥，僅對(duì)亞胺培南較敏感（100.00%），見(jiàn)表2。

3討論

肺炎克雷伯菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌[4]，自從1988年美國(guó)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，新質(zhì)粒以每年1～2個(gè)的數(shù)目被發(fā)現(xiàn)，近幾年質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶相繼被發(fā)現(xiàn)[5]，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC呈持續(xù)高表達(dá)，且可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合等方式轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌，從而造成耐藥菌株的廣泛產(chǎn)生。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶在大腸桿菌、克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌及奇異變形桿菌中持續(xù)高表達(dá)，因此產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌所致的感染病死率更高[6]，從而增加了臨床抗感染治療的難度，通過(guò)檢測(cè)肺炎克雷伯菌中AmpC酶在我院的分布以及其藥敏情況，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素提供一定的依據(jù)。

本試驗(yàn)采用頭孢西丁藥敏紙片法對(duì)臨床分離的97株肺炎克雷伯菌進(jìn)行初篩，其中可疑產(chǎn)AmpC酶菌株40株。對(duì)初篩陽(yáng)性肺炎克雷伯菌采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)其基因型，結(jié)果顯示7株肺炎克雷伯菌擴(kuò)增出目的片段大小約405 bp的條帶，根據(jù)片段大小確定為DHA型AmpC酶，產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌的總檢出率7.22%，低于張戡等[7]的報(bào)道，考慮可能與收集菌株時(shí)間范圍較小有關(guān)，下一步可通過(guò)研究更多菌株來(lái)減少誤差。世界范圍AmpC耐藥基因以CMY型多見(jiàn)，國(guó)內(nèi)以DHA-1型和ACT型多見(jiàn)，本研究對(duì)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行AmpC酶基因檢測(cè)，確定均為DHA型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8，9]，結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，DHA型可能是國(guó)內(nèi)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的主要基因型。

本研究藥敏結(jié)果顯示，產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為多重耐藥，對(duì)頭孢曲松、頭孢他定、頭孢吡肟等三、四代頭孢菌素均耐藥。四代頭孢菌素因能快速通過(guò)外膜屏障，一般推薦治療產(chǎn)AmpC酶菌株感染，本試驗(yàn)中產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對(duì)四代頭孢菌素頭孢吡肟也呈現(xiàn)高度耐藥（71.43%），考慮可能同時(shí)合并其他耐藥機(jī)制，因此本院對(duì)于產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染應(yīng)避免使用四代頭孢菌素;產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星等喹諾酮及氨基糖甙類(lèi)抗生素也高度耐藥，提示產(chǎn)酶肺炎克雷伯菌可能存在多種耐藥機(jī)制;產(chǎn)酶菌株僅對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素亞胺培南敏感，因碳青霉烯類(lèi)抗生素對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，與青霉素結(jié)合蛋白親和力強(qiáng)，因此臨床治療產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染首選碳青霉烯類(lèi)抗生素。同時(shí)，為了控制耐藥菌的流行，應(yīng)加強(qiáng)AmpC的檢測(cè)，以指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物。

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