王宗宇，張曉瑛，張小玲，楊永廣*，代相鵬*

(1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院人類疾病動(dòng)物模型國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué)第一人民醫(yī)院器官再造與移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

質(zhì)粒(plasmid)是廣泛存在于生物界的環(huán)狀雙鏈DNA分子[1]。質(zhì)粒DNA作為最基本的基因載體工具，在分子生物學(xué)、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[2]。質(zhì)粒載體含有3個(gè)共同的結(jié)構(gòu)：復(fù)制子，選擇性標(biāo)志和克隆位點(diǎn)，它們?cè)谫|(zhì)粒的表達(dá)與復(fù)制中發(fā)揮重要作用[3]。

人們通過(guò)在質(zhì)粒中插入目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，使目的基因在動(dòng)物模型中表達(dá)，可以研究動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生等情況，如P53基因在犬乳腺惡性腫瘤中高表達(dá)[4]，VIPR-1基因在高產(chǎn)太行雞中高表達(dá)[5]。從分子與細(xì)胞層次上探究這些基因的作用機(jī)制就需要構(gòu)建基因的重組質(zhì)粒，建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以進(jìn)行下一步的功能研究。現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的基因編輯工具CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，是以質(zhì)粒作為表達(dá)載體和基因修復(fù)序列的供體，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)地敲除、插入或替換基因組中特定的DNA序列，在瀕危物種保護(hù)、動(dòng)物品種改良和基因功能研究與疾病的治療中發(fā)揮重要的作用[6]。

疫苗是一種預(yù)防多種病毒性疾病的有效且通用的方法。從200年前首次成功應(yīng)用牛痘疫苗抵抗天花到現(xiàn)在，疫苗已大大減少了許多重要疾病對(duì)動(dòng)物的影響。核酸疫苗是一種具有極大發(fā)展?jié)摿η野踩行У囊呙?。首先通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建編碼疫苗抗原的DNA，并通過(guò)多種途徑傳遞給受體，然后DNA被宿主細(xì)胞吸收并轉(zhuǎn)錄為mRNA，翻譯成疫苗蛋白，所表達(dá)的蛋白質(zhì)被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源蛋白質(zhì)，并引發(fā)免疫反應(yīng)從而在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用。現(xiàn)在常用的核酸疫苗有貓免疫缺陷病毒疫苗、犬細(xì)小病毒疫苗、禽流感病毒疫苗等[7]?？贵w治療同樣是動(dòng)物疾病治療的有效手段，而抗體制備時(shí)也需要構(gòu)建重組質(zhì)粒作為抗原基因的載體，如制備非洲豬瘟病毒抗體等[8]。

獲得足夠量的質(zhì)粒是質(zhì)粒應(yīng)用的重要一步。生物學(xué)試驗(yàn)中質(zhì)粒的獲取方式主要是通過(guò)在大腸桿菌中擴(kuò)增，從而獲取大量的含有目的基因的載體質(zhì)粒。其主要過(guò)程是對(duì)感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取克隆菌落，LB培養(yǎng)基中搖菌擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提[9]。目前科研工作者已經(jīng)開發(fā)出很多質(zhì)粒抽提的方案，包括堿裂解法、加熱法、WELCH法、Brij法等。其中薩姆布魯克提出的堿裂解法操作簡(jiǎn)單、提取質(zhì)粒純度高、質(zhì)量好，是現(xiàn)今最為常用的質(zhì)粒DNA提取方法，但該方法存在用時(shí)過(guò)長(zhǎng)等不足[10]。針對(duì)這個(gè)不足，人們對(duì)該方法不斷改良，嘗試對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化以期縮短試驗(yàn)用時(shí)，但仍然存在提取DNA所需時(shí)間較長(zhǎng)，抽提的質(zhì)粒濃度不高等問題[11]。

基因工程相關(guān)的試驗(yàn)需要高濃度及高純度的質(zhì)粒DNA。然而質(zhì)粒得率和質(zhì)量會(huì)因目前使用的商業(yè)化試劑盒的不同而有較大的差異，從而影響了質(zhì)粒載體的應(yīng)用。低效率和低產(chǎn)量的質(zhì)粒提取會(huì)對(duì)人力、物力造成極大的浪費(fèi)，因此開發(fā)和優(yōu)化新的質(zhì)粒提取方法從而提高質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量是基因工程等領(lǐng)域中的一個(gè)值得重視的技術(shù)問題。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)商品試劑盒的質(zhì)粒提取程序進(jìn)行兩步優(yōu)化，顯著提高了質(zhì)粒提取的產(chǎn)量，并且沒有影響質(zhì)粒的質(zhì)量。應(yīng)用本試驗(yàn)方法，可以節(jié)省人力與物力，有助于解決某些質(zhì)粒在細(xì)菌中拷貝數(shù)低和提取效率低的問題，為質(zhì)粒載體更好地應(yīng)用于生命科學(xué)研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體和細(xì)胞系

試驗(yàn)所用的質(zhì)粒有pCDNA3.0-HA-GCN5,pLenti-GFP-DOCK8,pCDNA3.0-HA-BIRC5,pCMV-Flag-SPOP,pCDNA3.0-HA-p300,pCDNA3.0-GFP-BRD2和pLenti-GFP。HEK293細(xì)胞系用DMEM+10%胎牛血清(FBS)在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。豬成纖維(porcine fibroblast, PFF)細(xì)胞系用α MEM +15% FBS在38.5 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

試驗(yàn)中用到的主要試劑包括質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN，12362)，抗HA-Tag抗體(BioLegend，MMS-101P)，抗Vinculin抗體(Sigma，V4505)，抗GFP抗體(Clontech，8371-2)，抗BRD2抗體(Proteintech，22236-1-AP)，高葡萄糖 DMEM培養(yǎng)基(Gibco，C11995500BT)，αMEM培養(yǎng)基(Gibco，12571063)，胎牛血清(Gemini，900-108)，瓊脂糖(Thermo，75510019)，DNA 上樣緩沖液(TaKaRa，9157)，LB Agar(Invitrogen，22700025)，Protease inhibitor cocktail (Roche, 04693159001)，Phosphatase inhibitor(Bimake，B15001)，細(xì)胞裂解液EBC buffer(50 mmol/L Tris pH=7.5, 120 mmol/L NaCl, 0.5% NP-40)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(SDS 33.3 g，Glycerol 167 mL，DTT 25 g，ddH2O 500 mL)，ECL 發(fā)光液(Millipore，WBKLS0500)，TransStbl3 Chemically Competent Cell(Transgen，CD521-02)，P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit S(Lonza，V4XP-3032)。

1.3 質(zhì)粒提取

1.3.1 轉(zhuǎn)化

從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞(TransStbl3 Chemically Competent Cell)迅速置于冰上，待感受態(tài)細(xì)胞融化后取25～50 μL于1.5 mL EP管中，加入100 ng質(zhì)粒并混合均勻，冰上放置30 min后于42 ℃水浴中60 s，迅速置于冰上2 min，加入無(wú)抗菌素的400 mL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃，200 r/min搖床孵育1 h，取100 μL該LB均勻涂布于相應(yīng)抗性的平板上，于37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。

1.3.2 質(zhì)粒提取方法的優(yōu)化

用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，基本程序：取37 ℃ 孵育過(guò)夜的平板，用無(wú)菌槍頭刮取菌落，放入400 mL 含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)搖菌過(guò)夜(10～20 h)。離心收集菌體，10 mL P1懸浮菌體，10 mL P2裂解菌體，10 mL P3中和菌體以釋放質(zhì)粒，離心收集包含質(zhì)粒的上清液(簡(jiǎn)稱細(xì)菌裂解)，上清液過(guò)柱(簡(jiǎn)稱過(guò)柱)，清洗液清洗2次柱子，用15 mL洗脫液從柱子上洗脫質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱洗脫)，加入10.5 mL的異丙醇沉淀質(zhì)粒，離心沉降質(zhì)粒后去掉上清液，70%乙醇洗1遍后用0.1×TE溶解質(zhì)粒，收集到1.5 mL離心管10 000 r/min離心2 min，取上清。

為了優(yōu)化質(zhì)粒提取方法，設(shè)計(jì)了下面的試驗(yàn)：

組1(優(yōu)化)：在進(jìn)行大量搖菌前，進(jìn)行小管搖菌(優(yōu)化步驟1)，即取37 ℃孵育過(guò)夜的平板，用無(wú)菌槍頭刮取一些菌體，放入5 mL 含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃孵育6 h。在加入異丙醇后置于-20 ℃冰箱過(guò)夜然后進(jìn)行后面的離心操作(優(yōu)化步驟2)。

組2：只增加優(yōu)化步驟1，不實(shí)行優(yōu)化步驟2。

組3：不增加優(yōu)化步驟1，實(shí)行優(yōu)化步驟2。

組4(常規(guī))：不增加優(yōu)化步驟1，不實(shí)行優(yōu)化步驟2。

1.4 質(zhì)粒的濃度和雙酶切測(cè)定

用微量分光光度計(jì)(IMPLEN，NanoPhotometer P-Class)測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算不同質(zhì)粒提取組中得到的質(zhì)?？偭?，記錄A260/A280和A260/A230值，用1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過(guò)紫外照射檢測(cè)質(zhì)粒超螺旋情況，評(píng)判質(zhì)粒質(zhì)量。將提取的HA-BIRC5質(zhì)粒用EcoRⅠ與XhoⅠ進(jìn)行了雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效率。

1.5 質(zhì)粒的表達(dá)檢測(cè)

將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP-DOCK8質(zhì)粒用Lipo2000(Invitrogen，11668019)根據(jù)說(shuō)明書轉(zhuǎn)染到前1 d準(zhǔn)備好的6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HEK293細(xì)胞中，48 h后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況。將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP-DOCK8，2 μg HA-GCN5，2 μg HA-BIRC5和2 μg pLenti-GFP質(zhì)粒用Lipo2000(Invitrogen，11668019)根據(jù)說(shuō)明書轉(zhuǎn)染到前1 d準(zhǔn)備好的6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HEK293細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。將PFF細(xì)胞消化下來(lái)后，加入Lonza電轉(zhuǎn)液，用電轉(zhuǎn)儀(4D-Nucleofector Core Unit，Lonza)設(shè)置DT130電轉(zhuǎn)條件將2種方法提取的5 μg pLenti-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到PFF中。

轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)48 h后收集細(xì)胞，加入EBC蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞后離心，取上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，樣品保存于-20 ℃。用SDS-PAGE分離后，加入相應(yīng)的抗體后顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.6 體內(nèi)泛素化試驗(yàn)

將2 μg His-ub，2 μg GFP-BRD2，2 μg不同方法提取的Flag-SPOP 轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，36 h后加入20 μmol/L MG132處理6 h。細(xì)胞用裂解液A(6 mol/L guanidine-HCl, 0.1 mol/L Na2HPO4/PO4, 10 mmol/L imidazole[pH=8.0]) 裂解并進(jìn)行超聲破碎。10 000 r/min離心后取上清液與鎳一三乙酸 (Ni-NTA) (QIAGEN) 在常溫孵育3 h。用裂解液A 洗滌2遍后，用液體A/TI (1體積buffer A和3體積buffer TI)洗滌2遍，然后用溶液TI(25 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L imidazole[pH=6.8])洗滌1遍后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后進(jìn)行免疫印跡。

1.7 體內(nèi)乙?；囼?yàn)

將HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.5 μg Flag-P53，3 μg不同方法提取的HA-P300。細(xì)胞裂解后計(jì)算濃度取1 000 μg，用EBC蛋白裂解液將體積補(bǔ)至500 μL，加8 μL HA-beads (GE Healthcare)，20 μL 5 mol/L NaCl。4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育3 h。用NETN buffer (20 mmol/L Tris, pH值8.0, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA， 0.5% NP-40)洗滌4遍后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后進(jìn)行免疫印跡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

熒光顯微鏡圖片中的GFP熒光強(qiáng)度和Western blot結(jié)果的灰度等均由Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒提取方法的優(yōu)化

以pLenti-GFP為目的質(zhì)粒，用不同的方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取。如表1所示，與組4相比，組1至組3在一定程度上都提高了質(zhì)粒的產(chǎn)量，其中組1質(zhì)粒產(chǎn)量提高的最多，表明兩步優(yōu)化能得到最佳的質(zhì)粒提取效果。

表1 不同方法對(duì)質(zhì)粒提取效率的影響

2.2 不同方法提取的質(zhì)粒的產(chǎn)量的檢測(cè)

如表2所示，常規(guī)提取方法獲得的質(zhì)?？偭繛?.6～0.9 mg，而優(yōu)化提取方法獲得的質(zhì)?？偭繛?.8～1.2 mg。常規(guī)方法提取質(zhì)粒的A260/A280和A260/A230比值(A260/A280=1.90±0.05，A260/A230=2.40±0.3) 與優(yōu)化方法提取質(zhì)粒的A260/A280和A260/A230比值(A260/A280=1.90±0.05，A260/A230=2.40±0.2)無(wú)顯著差異。

表2 不同方法的質(zhì)粒提取效率

2.3 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳和雙酶切

對(duì)2種方法提取的質(zhì)粒進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，優(yōu)化方法和常規(guī)方法提取質(zhì)粒的超螺旋條帶沒有明顯區(qū)別(圖1A～1E)。2種方法提取的HA-BIRC5質(zhì)粒用EcoRⅠ與XhoⅠ進(jìn)行了雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效率，結(jié)果表明優(yōu)化方法沒有影響質(zhì)粒的酶切效率(圖1F)。

M. DNA Marker；1. 常規(guī)方法提取的質(zhì)粒；2. 優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒。A. GFP-DOCK8；B. Flag-SPOP；C. HA-GCN5；D. HA-BIRC5；E. HA-P300；F. 質(zhì)粒HA-BIRC5雙酶切產(chǎn)物

2.4 質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)效率的檢測(cè)

用熒光顯微鏡檢測(cè)pLenti-GFP-DOCK8在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒表達(dá)升高(圖2)。免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)pLenti-GFP-DOCK8(圖3A)、HA-GCN5(圖3B)、HA-BIRC5(圖3C)和pLenti-GFP(圖3D)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果表明優(yōu)化方法提取的質(zhì)粒的表達(dá)效率沒有降低。用熒光顯微鏡檢測(cè)pLenti-GFP質(zhì)粒在PFF細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明2種方法提取的質(zhì)粒均能高效地轉(zhuǎn)染到PFF細(xì)胞中(圖4)。

圖2 熒光顯微鏡檢測(cè)pLenti-GFP-DOCK8在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

A. GFP-DOCK8; B. HA-GCN5; C. HA-BIRC5; D. pLenti-GFP

圖4 熒光顯微鏡檢測(cè)pLenti-GFP在PFF中的表達(dá)

2.5 質(zhì)粒生物學(xué)功能的檢測(cè)

乙?；囼?yàn)、泛素化試驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)降解試驗(yàn)的結(jié)果表明，2種方法提取的散斑型BTB/POZ蛋白(speckle type BTB/POZ protein, SPOP)具有相似的促進(jìn)底物布羅莫結(jié)構(gòu)域蛋白2(bromodomain containing 2, BRD2)泛素化(圖5A)和降解的能力(圖5B)，2種方法提取的P300均能有效促進(jìn)P53的乙酰化(圖5C)。

A. Western blot檢測(cè)SPOP促進(jìn)BRD2泛素化；B. Western blot檢測(cè)SPOP降解BRD2；C. 免疫共沉淀檢測(cè)P300促進(jìn)P53乙?；?/p>

3 討論

質(zhì)粒DNA作為基因表達(dá)載體被廣泛應(yīng)用在基因工程中。所有提取質(zhì)粒DNA的方法基本都包括培育菌體使質(zhì)粒擴(kuò)增，回收細(xì)菌并使其裂解，分離并純化質(zhì)粒這3個(gè)基本步驟。目前關(guān)于質(zhì)粒提取的方法主要有堿裂解法、煮沸法、WELCH法等。質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量是影響質(zhì)粒應(yīng)用的重要因素。而質(zhì)粒提取質(zhì)量與效率受到菌體濃度、培育時(shí)間、提取方法等多個(gè)因素的影響。因此，研究者們通過(guò)嘗試不同的方法對(duì)質(zhì)粒的提取條件進(jìn)行改良，以期提高質(zhì)粒的提取產(chǎn)量，并縮短質(zhì)粒的提取時(shí)間。

薛仁鎬等[12]通過(guò)反應(yīng)條件的改良，建立了一種極為快速的質(zhì)粒DNA堿裂解法，改良方法大大縮短了質(zhì)粒DNA制備時(shí)間，但質(zhì)粒得率較低。胡小青等[13]在低溫條件下進(jìn)行質(zhì)粒提取，以增加質(zhì)粒抽提產(chǎn)量，并增加其在細(xì)胞中表達(dá)效率的方法，該方法發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒提取過(guò)程中各個(gè)步驟均對(duì)溫度敏感，低溫條件是增加質(zhì)粒產(chǎn)量的最優(yōu)選擇，但是操作過(guò)程需全程在4 ℃條件下進(jìn)行，需要冷庫(kù)才能進(jìn)行，時(shí)間也沒有得到明顯縮短。朱開春等[14]通過(guò)對(duì)在傳統(tǒng)的煮沸裂解法進(jìn)行改進(jìn)，并選擇質(zhì)粒保有率高、適合發(fā)酵的 TOP10 菌株，在70 ℃的裂解溫度下進(jìn)行質(zhì)粒提取，從而簡(jiǎn)化了抽提過(guò)程，縮短了提取時(shí)間，同時(shí)增加了質(zhì)粒 DNA 的提取效率。但缺點(diǎn)是煮沸法較易破壞質(zhì)粒 DNA 的結(jié)構(gòu)，且不適用于沒有氯霉素處理的培養(yǎng)物。吳韶光等[15]對(duì)WELCH法進(jìn)行了改進(jìn)，去掉加RNase和酚:氯仿抽提步驟，使WELCH法更為簡(jiǎn)捷、方便。但因?yàn)樯胁磺宄脑?，用這種方法粗提的質(zhì)粒DNA在4 ℃存放時(shí)，DNA常常自行降解。本研究通過(guò)綜合他人的試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)，在常規(guī)的提取程序中增加了提前小管搖菌和異丙醇-20 ℃過(guò)夜孵育，其中小搖過(guò)程可能有助于細(xì)菌的擴(kuò)增從而提高初始菌液的濃度，而異丙醇低溫過(guò)夜步驟可能降低質(zhì)粒DNA在異丙醇中的溶解度從而有助于質(zhì)粒的醇沉，使質(zhì)粒提取的產(chǎn)量提高了20%～40%，提取的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、雙酶切等試驗(yàn)，顯示質(zhì)量并沒有降低。質(zhì)粒的生物學(xué)功能通過(guò)蛋白泛素化和乙酰化試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。SPOP是一種Cullin3家族的E3泛素連接酶，SPOP與底物結(jié)合后對(duì)底物蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化和降解。目前已經(jīng)知道的SPOP的底物有多種，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，SPOP能夠結(jié)合、泛素化并降解BET(bromodomain and extra-terminal)蛋白質(zhì)家族BRD2、BRD3、BRD4等[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化方法沒有降低SPOP促進(jìn)底物泛素化和降解的能力。

雖然本研究?jī)?yōu)化了質(zhì)粒的提取方法，但是質(zhì)粒產(chǎn)量仍然有待提高，后面應(yīng)該在該方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)提取策略，以期更大地提高質(zhì)粒產(chǎn)量?？傊?，本研究使用常見試劑盒，通過(guò)優(yōu)化質(zhì)粒的提取步驟，提高了質(zhì)粒抽提效率，節(jié)省了時(shí)間和財(cái)力、物力，為進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)粒提取方法和思路上提供重要的參考和指導(dǎo)，也為需要大量質(zhì)粒DNA的試驗(yàn)，如腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的基因治療等降低了質(zhì)粒提取的成本。