張雨陽(yáng)，金一

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

精子獲能會(huì)引起鈣離子和碳酸氫根離子流入、增加細(xì)胞內(nèi)pH值和膽固醇流出。酸堿度變化激活可溶性精子腺苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷，從而激活蛋白激酶A(PKA)。最近的研究表明PKA使26S蛋白酶體磷酸化，并增加其糜蛋白酶樣蛋白水解活性[1]。蛋白酶體一旦被PKA激活，可以通過(guò)一個(gè)反饋環(huán)直接或間接調(diào)節(jié)底物蛋白絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化。獲能時(shí)的膽固醇流出會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)膜流動(dòng)性增加，蛋白質(zhì)重新分布和形成與透明帶結(jié)合的多蛋白復(fù)合物[2]。這些多蛋白復(fù)合物中鑒定出來(lái)蛋白質(zhì)酶體亞單位和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)的其他成分，表明UPS可能參與獲能過(guò)程中多復(fù)合物相關(guān)蛋白的翻譯后修飾。

本文綜述了UPS的主要組成及在精子獲能過(guò)程中的作用。

1 UPS概述

蛋白質(zhì)是通過(guò)共價(jià)連接到泛素蛋白的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制稱為泛素化。泛素化是通過(guò)小分子伴侶蛋白泛素的共價(jià)連接，對(duì)靶蛋白進(jìn)行的穩(wěn)定、可逆的翻譯后修飾。26S蛋白酶體復(fù)合體識(shí)別附著在蛋白質(zhì)上的泛素鏈的能力可以解釋細(xì)胞蛋白質(zhì)是如何通過(guò)泛素化來(lái)降解的。蛋白質(zhì)的泛素化通過(guò)依次激活3種酶來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]，見圖1。泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第一個(gè)酶是泛素激活酶E1(UBA1)。它的任務(wù)是與單個(gè)泛素分子形成瞬態(tài)硫醇酯鍵，該反應(yīng)稱為泛素活化?；钴S的UBA1對(duì)豬的成功受精至關(guān)重要。被特定的UBA1抑制劑阻斷會(huì)導(dǎo)致無(wú)法正確受精豬卵母細(xì)胞[4]。在從UBA1酶分離分子后，泛素結(jié)合酶E2與活化的泛素分子建立了瞬時(shí)的硫醇酯鍵。該復(fù)合物被泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第3個(gè)必需酶，即E3型泛素連接酶識(shí)別，該酶與底物蛋白結(jié)合。結(jié)合后，E3酶與E2酶相互作用，以使附著E2的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。泛素分子通過(guò)催化泛素的C末端和底物的內(nèi)部賴氨酸殘基之間的共價(jià)結(jié)合而與底物蛋白連接。因此，E3型連接酶是泛素化的底物特異性元件，并負(fù)責(zé)確定哪些蛋白質(zhì)將被降解。泛素分子通過(guò)E3酶與底物結(jié)合的單泛素相連，有時(shí)還受到鏈延長(zhǎng)因子(E4酶)的輔助。多泛素鏈由泛素與底物串聯(lián)而成，由26S蛋白酶體識(shí)別，26S蛋白酶體是一種多催化蛋白酶，能將泛素化的蛋白降解為小肽。典型26S蛋白酶體由一個(gè)空心的20S核心組成，在兩端或一端有一個(gè)19S調(diào)控顆粒。19S顆粒能識(shí)別、結(jié)合和移除連接到蛋白酶體降解蛋白上的多泛素鏈。底物蛋白經(jīng)過(guò)展開并轉(zhuǎn)運(yùn)到20S核心，蛋白酶體降解成小肽，然后從20S核心釋放出來(lái)。多泛素鏈被分解成重新進(jìn)入泛素循環(huán)的單分子[5]。

圖1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通路

在精子獲能過(guò)程中，UPS調(diào)節(jié)一些精子表面蛋白和精子血漿蛋白，26S蛋白酶體的一些亞基被翻譯后修飾[6]。研究表明，UPS調(diào)節(jié)精子獲能誘導(dǎo)的精子中鋅離子外流[7]和精漿蛋白如SPINK2和DQH[8]從精子表面的脫落。有報(bào)道關(guān)于綠色熒光蛋白酶體的轉(zhuǎn)基因GFP-PSMA1公豬的研究確定了在獲能過(guò)程中通過(guò)UPS進(jìn)行翻譯后修飾的可能目標(biāo)，例如MFGE-8、ADAM5、AWN1、ACRBP和SPINK2。然而，沒(méi)有關(guān)于這些蛋白在獲能過(guò)程中如何被UPS調(diào)節(jié)的研究。哺乳動(dòng)物精子獲能過(guò)程中一些UPS的靶點(diǎn)和底物已被確定[9]，但仍然缺乏精子獲能過(guò)程中UPS靶點(diǎn)的復(fù)雜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。這些靶蛋白的研究將有助于全面理解精子獲能過(guò)程中UPS的參與，也將揭示導(dǎo)致頂體細(xì)胞外分泌和過(guò)度活化的下游事件。

2 泛素化酶

2.1 激活酶(E1)

E1是UPS的起始步驟[10]。目前已發(fā)現(xiàn)2種E1酶，UBE1/UBA1和UBA6/UBE1L2。UBA1是負(fù)責(zé)大多數(shù)泛素介導(dǎo)過(guò)程的E1酶。UBA6介導(dǎo)的泛素激活目前僅限于特定的蛋白泛素化，因?yàn)橐阎腅2酶中只有一種特定的E2酶可與UBA6偶聯(lián)。E1是必須激活泛素并將其有效轉(zhuǎn)移至E2活性位點(diǎn)的多域酶。該功能對(duì)于細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要，因?yàn)槿缣禺愋砸种萍?xì)胞中E1，信號(hào)傳導(dǎo)的破壞導(dǎo)致幾乎整個(gè)UPS停機(jī)[11]。

最近研究表明，在小鼠、大鼠、野豬和人[12]的精子中，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)確定了獲能過(guò)程中E1和多個(gè)蛋白酶體亞基發(fā)生磷酸化[13]。UBA1的活性對(duì)于精子獲能是必需的。有研究發(fā)現(xiàn)UBA1的抑制防止獲能誘導(dǎo)的精子黏附素AQN1和頂體酶抑制劑的丟失，影響精子頂體外膜的重塑，降低精子使卵母細(xì)胞體外受精的能力[4]。UBA1可能是通過(guò)影響精子-卵子融合后的精子增大和精子減數(shù)分裂染色體的分離來(lái)降低精子的受精能力[14]。與精子-ZP互作有關(guān)的一些問(wèn)題可通過(guò)在精子獲能過(guò)程中抑制E1酶來(lái)解決。

2.2 連接酶(E2)

E2酶是泛素化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，它分別與E1和E3相互作用。關(guān)于UPS，存在一個(gè)令人費(fèi)解的問(wèn)題是為什么不是將泛素直接從E1轉(zhuǎn)移到E3。一些研究人員認(rèn)為，E2酶可以與識(shí)別并選擇不同靶點(diǎn)的不同類型的E3結(jié)合，從而在確定標(biāo)記的蛋白質(zhì)是否會(huì)降解或參與非蛋白水解過(guò)程中起決定性作用。換句話說(shuō)，E3主要選擇底物，而E2決定底物的命運(yùn)。所有E2都有1個(gè)約150個(gè)殘基的Ub共軛(UBC)結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包含泛素連接的催化半胱氨酸，以及與E1和E3蛋白相互作用所需的結(jié)合域。根據(jù)先前對(duì)來(lái)自不同E2的UBC域的結(jié)構(gòu)分析，它們彼此非常相似[15]。因此，1個(gè)E2可以與多個(gè)E3s相互作用。目前的UPS研究中關(guān)于E2酶識(shí)別多種E3和特定底物的驅(qū)動(dòng)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)非常有限。E2酶是否可能具有獨(dú)立于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的其他生物學(xué)功能仍未可知。

研究表明，E2參與精子的發(fā)生，獲能和受精過(guò)程。E2酶UBCs是一個(gè)特別參與精子發(fā)生的大家族。例如，UBC4、UBC4-1和UBC4-2在精子不同部位表達(dá)，說(shuō)明它們?cè)诰影l(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮不同的作用。有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物E2酶Ubc9與HsRad51重組酶相互作用，表明Ubc9可能在精子發(fā)生過(guò)程中的減數(shù)分裂中起調(diào)節(jié)作用[16]。E2酶HR6B及其同源物HR6A在睪丸中高度表達(dá)，HR6B同源基因的失活會(huì)導(dǎo)致小鼠不育。但HR6A缺陷小鼠是可育的[17]。在海鞘睪丸中檢測(cè)到UBC4的同源物，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)在精子頭部和尾部觀察到，這可能意味著它參與精子發(fā)生和精子獲能。

2.3 結(jié)合酶(E3)

泛素結(jié)合酶(E3)可以催化泛素從E2酶轉(zhuǎn)移至底物，從而調(diào)節(jié)真核生物中的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。整個(gè)泛素蛋白酶體系統(tǒng)的特異性和效率很大程度上取決于識(shí)別特定底物的E3酶[18]。泛素分子的數(shù)量以及與靶蛋白相連的泛素的特定氨基酸殘基決定了泛素化對(duì)靶蛋白的影響。最常見的結(jié)合靶蛋白形成蛋白鏈的連接方法是利用賴氨酸48(K48)和賴氨酸63(K63)連接。UPS容易消除K48多聚泛素化的底物[19]，而K63多聚泛素化或單泛素化的底物則通過(guò)自噬消除[20]。表明可通過(guò)不同結(jié)構(gòu)的多聚泛素鏈識(shí)別底物，從而為不同的蛋白質(zhì)降解途徑提供降解信號(hào)[21]。

有較多研究發(fā)現(xiàn)E3酶在調(diào)節(jié)睪丸和精子發(fā)生過(guò)程中起到重要作用[22]。E3酶更多是被發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生過(guò)程中的組蛋白的泛素化中起作用，尤其是H2A和H2B的泛素化被認(rèn)為是精子發(fā)生過(guò)程中染色質(zhì)重塑的重要表觀遺傳標(biāo)志之一[23]。組蛋白的泛素化在組蛋白與魚精蛋白交換之前至關(guān)重要。最近發(fā)現(xiàn)一種H2A泛素化的新型E3酶PHF7，在精子發(fā)生過(guò)程中特異性表達(dá)，與小鼠精子發(fā)生過(guò)程中組蛋白到魚精蛋白的交換有關(guān)[24]。盡管大量研究表明E3酶在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，但在精子獲能過(guò)程中的詳細(xì)的泛素化途徑尚未被揭示。例如，一些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)泛素化，而特定的對(duì)應(yīng)酶尚未被闡明。

3 蛋白酶體

最近的研究發(fā)現(xiàn)表明，26S蛋白酶體是真核細(xì)胞中的主要蛋白酶體，通過(guò)利用ATP分子的水解作用來(lái)修飾復(fù)雜的底物結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)組并降解許多調(diào)節(jié)蛋白以及受損或錯(cuò)誤折疊的多肽[25]。這種ATP依賴的蛋白水解復(fù)合物由中空的圓柱形20S核心顆粒組成，在該顆粒中蛋白質(zhì)被降解，結(jié)合泛素化底物的19S調(diào)節(jié)顆粒分解泛素鏈，然后將多肽展開并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核心顆粒中[26]。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多泛素化蛋白結(jié)合到蛋白酶體，被去泛素化降解[27]。同樣，26S蛋白酶體降解泛素蛋白的能力受到多方面調(diào)節(jié)，并且可以通過(guò)幾種合成后機(jī)制改變[28]。蛋白酶體調(diào)節(jié)的形式具有重要的生理重要性。

蛋白酶體在精子獲能過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致精子蛋白磷酸化程度的增加。它可以直接或間接調(diào)節(jié)Ser和Thr的磷酸化，從而在獲能過(guò)程中降解絲氨酸磷酸酶，蘇氨酸激酶或Thr殘基磷酸化的蛋白質(zhì)。蛋白酶體降解的靶標(biāo)是AKAP3。該蛋白將PKA鎖定在精子尾巴中，在獲能條件下，通過(guò)蛋白酶體機(jī)制增強(qiáng)了AKAP3的降解使PKA和AKAP3之間的解離和細(xì)胞內(nèi)堿化作用。AKAP的解離和降解使PKA從尾巴向頭部轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)了頂體反應(yīng)[29]。蛋白酶體的抑制可防止牛精子獲能過(guò)程中PKA誘導(dǎo)的AKAP3蛋白酶體降解。目前，尚不清楚AKAP3和其他蛋白酶體靶向的AKAP是在獲能前被組成性泛素化，還是在獲能過(guò)程中被精子內(nèi)在的UPS泛素化。

蛋白酶體活性還參與精子表面蛋白的重新分布和轉(zhuǎn)換，涉及到精子輸卵管上皮層(MFGE8，ADAM5，AQN1)，精子-ZP結(jié)合(MFGE8，AQN1)形成以及精子質(zhì)膜和卵子的融合(ADAM5)[30]。因此，精子蛋白酶體與頂體功能的關(guān)系在精子獲能時(shí)就開始了，并可能影響頂體重塑以及精子與卵子的相互作用。精子蛋白酶體可能參與頂體的胞吐，發(fā)生在頂體反應(yīng)期間Ca2+流入平臺(tái)期的上游。這可以減少Ca2+流入的持續(xù)階段，而不影響最初的瞬時(shí)峰值。當(dāng)精子與ZP結(jié)合并發(fā)生頂體外分泌時(shí)，蛋白酶體能夠降解部分ZP蛋白。具體來(lái)說(shuō)，頂體外分泌導(dǎo)致與頂體內(nèi)膜相關(guān)的蛋白酶體暴露，當(dāng)精子頭部通過(guò)ZP時(shí)，蛋白酶體可能提供持續(xù)的蛋白水解酶活性[31]。最近的研究通過(guò)構(gòu)建計(jì)算模型清楚地表明26S蛋白酶體復(fù)合物在精子信號(hào)傳導(dǎo)中具有活性。它參與生殖過(guò)程的所有步驟，包括精子-透明帶相互作用[30]和在獲能過(guò)程中發(fā)生的蛋白質(zhì)磷酸化[4]，從而促使獲能的精子釋放出來(lái)[32]。

目前發(fā)現(xiàn)人類中不育男性的弱精子癥和畸胎精子癥伴隨著精子蛋白酶體酶活性的降低和蛋白酶體激活子4(PSME4)基因在畸胎精子癥患者中的表達(dá)下調(diào)[32]。目前尚不清楚這些精子是否不能進(jìn)行獲能和頂體胞吐，以及這種失敗是否與蛋白酶體酶活性降低有關(guān)。研究表明不育患者的精漿中含有針對(duì)精子質(zhì)膜中抗原的抗體。其中一些抗原被鑒定為蛋白酶體亞單位。因此，抗蛋白酶體亞單位抗體的存在可能是不育的一個(gè)原因。這樣，新的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步的研究開辟了道路，可以為精子生理學(xué)提供新的信息，并為潛在的設(shè)計(jì)和治療男性不育癥的策略提供新的觀點(diǎn)。

4 應(yīng)用與展望

精子UPS的應(yīng)用研究有很多領(lǐng)域，包括人類不育診斷檢測(cè)蛋白酶體和測(cè)量蛋白酶體活性與特定熒光底物，以及通過(guò)在精子和受精中添加蛋白酶體刺激物治療蛋白酶體相關(guān)男性不育。雖然對(duì)精子獲能時(shí)的蛋白酶體蛋白水解作用知之甚少，但最近的一項(xiàng)研究表明，精子攜帶的泛素化蛋白質(zhì)的蛋白酶體蛋白水解發(fā)生在睪丸后附睪精子成熟過(guò)程中[33]。此外，在哺乳動(dòng)物精子中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)泛素連接酶和去泛素化酶，它們可以支持睪丸后泛素化和精子蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)[34]。通過(guò)限制不必要的自發(fā)獲能，根據(jù)精子蛋白酶體活性選擇繁殖公畜，冷凍精液人工授精后，利用蛋白酶體刺激成分開發(fā)培養(yǎng)基、擴(kuò)展劑和冷凍保護(hù)劑以提高受孕率，可以提高家畜的繁殖性能，提高精液性別鑒定后的精子活力，同時(shí)減少每劑量精子的數(shù)量，以便在生產(chǎn)系統(tǒng)中使用更優(yōu)質(zhì)基因。