趙英博，張君濤，賀來增，張帆，李怡屏，李娟娟，閆鵬輝，張志平，鄧立新

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

隨著養(yǎng)牛業(yè)的產(chǎn)業(yè)化和集約化發(fā)展，生殖系統(tǒng)疾病也越來越多，繁殖性能下降導(dǎo)致巨大損失。目前，常見的生殖系統(tǒng)疾病主要包括胎衣不下、卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜炎和陰道炎等，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，其中子宮疾病急劇上升，引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。子宮是奶牛生殖系統(tǒng)的組成部分，主要包括外層漿膜、中層子宮肌層和內(nèi)層子宮內(nèi)膜，其中子宮內(nèi)膜是子宮干細(xì)胞的存在部位[1]，在動(dòng)物的發(fā)情、妊娠和分娩等過程中發(fā)揮著重要作用[2-4]。因此，建立成熟的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系對(duì)于研究子宮內(nèi)膜生理和病理具有重要意義[5]。

類器官是源于干細(xì)胞或祖細(xì)胞的衍生結(jié)構(gòu)[6]，具備類似完整器官的三維結(jié)構(gòu)和生理學(xué)功能。類器官培養(yǎng)方法的建立為組織的正常發(fā)育和疾病致病機(jī)理的研究提供了平臺(tái)[7]。目前，已經(jīng)建立了多種類器官的培養(yǎng)方法，如胃[8]、腸[9]、腎臟[10]、肝臟[11]和腦[12]等。然而對(duì)子宮類器官的研究很少，而且主要通過細(xì)胞混合培養(yǎng)或細(xì)胞支架等方法研究人子宮類器官[13-14]，國內(nèi)對(duì)于這一方面的研究更是鮮有報(bào)道。國內(nèi)對(duì)于子宮的研究多局限于體外模型和細(xì)胞方面，并已對(duì)人[15]、羊[16]、牛[17]等多種子宮內(nèi)膜進(jìn)行體外上皮細(xì)胞培養(yǎng)，已建立相應(yīng)的培養(yǎng)技術(shù)，但子宮細(xì)胞由于局限性[18]，市面尚未有相關(guān)細(xì)胞系。本試驗(yàn)通過組織學(xué)檢查選取完整的子宮內(nèi)膜組織，比較不同月齡的子宮類器官培養(yǎng)率，以子宮類器官為基礎(chǔ)分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，提高子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)效率，為建立完善的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞模型提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4～6月齡南陽黃牛胎牛，購于河南省鄭州市肉牛屠宰場。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F 12培養(yǎng)基(Hyclone)；血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(Aladdin)；非必需氨基酸(Gibco公司)；兩性霉素B、慶大霉素(Coolaber)；PBS粉末、轉(zhuǎn)鐵蛋白、青鏈霉素混合液、丙酮酸鈉(Solarbio)；Wnt 3a[Mouse](Abcam)；表皮生長因子(EGF)[Human](Bio-Techne)；R-spondin-1[Human]、Noggin[Human](MCE)；抗體角蛋白18(KRT18)[Rabbit](Bioss)、異硫氰酸熒光素(FITC)[Rabbit](Bioss)。

1.1.3 工作液配制

PBS液：1 U/mL青鏈霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、2.5 μg/mL慶大霉素的0.01 mol/L PBS。

細(xì)胞培養(yǎng)液：1 U/mL青鏈霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、2.5 μg/mL慶大霉素、5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、1 μmoL/mL丙酮酸鈉、0.1 μmoL/mL非必須氨基酸、10%血清的DMEM/F12。

類器官培養(yǎng)液：156 ng/mL EGF、62.5 ng/mL Noggin、62.5 mg/mL Wnt3a、62.5 ng/mL R-spondin-1、10%血清的DMEM/F12。

胰酶：0.25 g胰蛋白酶和0.04 g EDTA溶于100 mL PBS中。

1.2 方法

1.2.1 胎牛子宮形態(tài)觀察

胎牛離體后，無菌操作下獲取胎牛子宮， PBS液清洗3遍，將子宮從中間分開，暴露子宮內(nèi)側(cè)，觀察胎牛子宮結(jié)構(gòu)。

1.2.2 子宮類器官培養(yǎng)

無菌操作下對(duì)胎牛子宮進(jìn)行處理，分離子宮內(nèi)膜組織，剪碎為1～2 mm組織塊，用PBS液進(jìn)行清洗，挑選組織再次清洗。組織轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，轉(zhuǎn)移至含PBS液的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下挑選組織塊，轉(zhuǎn)移至含200 μL類器官培養(yǎng)液的96孔板中，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察出芽情況。各選取3頭4～6月齡的牛胎兒子宮，比較類器官出芽率。

1.2.3 子宮類器官和組織塊分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞比較

類器官分離原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞：取完整的類器官轉(zhuǎn)移至含細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，吹打分離出芽組織為細(xì)小組織塊， 2 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況。培養(yǎng)后觀察液體情況，約每48 h更換新的培養(yǎng)液。

組織塊分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞：取1.2.2中剪碎離心后的組織塊，再次添加細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，重新加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液，將其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況。培養(yǎng)后觀察液體情況，大約每48 h需要更換新的培養(yǎng)液，長時(shí)間未貼壁組織塊應(yīng)及時(shí)清理。

1.2.4 細(xì)胞純化與傳代

當(dāng)組織周圍有細(xì)胞向外延伸生長，形成細(xì)胞集落，用PBS液清洗2遍，胰酶消化2 min進(jìn)行純化，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，棄去，重新加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況，可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行多次純化。細(xì)胞貼滿底部之后進(jìn)行傳代，用PBS清洗液清洗2遍，1 mL胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞起來80%以上后加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，重新加入細(xì)胞培養(yǎng)液分離至2個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)獲得傳代細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞生長曲線

選取P3代細(xì)胞，將細(xì)胞消化離心之后，以1.2×104個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種后每12 h用PBS液清洗細(xì)胞，胰酶消化后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞鑒定

胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞爬片，貼壁后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定30 min， PBS浸洗3次，每次5 min，用0.5% Triton X-100(PBS配制)處理15 min，PBS清洗3次，每次5 min；3% BSA室溫孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，加入一抗KRT18，封閉四孔板，4 ℃過夜，PBS清洗3次，每次放于搖床 5 min。加入二抗FITC，避光室溫下孵育1 h，PBS清洗5次，每次放于搖床3 min。用DAPI進(jìn)行復(fù)染，避光室溫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，避光用熒光顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

類器官采用SPSS25.0進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，且認(rèn)為P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 子宮形態(tài)染色

子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部呈1 mm的突起，表層覆蓋內(nèi)膜(圖1)。

A. 子宮外觀；B. 子宮黏膜

2.2 不同月齡胎牛子宮類器官培養(yǎng)

對(duì)4、5、6月齡的胎牛進(jìn)行子宮類器官培養(yǎng)，每月齡選取胎牛3只，組織塊進(jìn)行類器官培養(yǎng)，可以看到組織塊發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變。48 h后，組織中的子宮相關(guān)干細(xì)胞經(jīng)過增殖，向外圍分布，突破組織隔膜形成透明圓形結(jié)構(gòu)(圖2A)，120 h后開始形成芽狀結(jié)構(gòu)，隨后芽狀結(jié)構(gòu)增多，形成類器官(圖2B)。計(jì)算組織塊出芽率，對(duì)4、5、6月齡平均出芽率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示在類器官培養(yǎng)中，4月齡相比于5、6月齡出芽率較高(P<0.05)；5月齡相較于6月齡出芽率較高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

A.組織形成圓形結(jié)構(gòu)；B. 4月齡胎牛組織出芽形成類器官；C. 5月齡胎牛組織出芽形成類器官；D. 6月齡胎牛組織出芽形成類器官

2.3 組織塊和子宮類器官分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

組織塊分離原代子宮內(nèi)膜過程中，組織塊分離法獲得的組織塊一般在第4天后貼壁(圖3A)，在第7天后觀察到細(xì)胞在組織塊周圍生長(圖3B)。類器官分離的組織一般在第4天之后即可觀察到以出芽組織為中心，細(xì)胞向周圍延伸生長(圖3C)，168 h后大部分空白處被細(xì)胞占據(jù)(圖3D)。在觀察細(xì)胞貼壁過程中，有部分的零散細(xì)胞進(jìn)行貼壁生長，大部分為成纖維細(xì)胞，呈現(xiàn)梭形，且在組織塊分離培養(yǎng)中多于類器官培養(yǎng)。組織塊周圍的細(xì)胞多呈多邊形，且細(xì)胞間連接緊密，逐漸向外延伸。

注：數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

A.組織塊分離細(xì)胞第4天；B.組織塊分離細(xì)胞第7天；C.類器官分離細(xì)胞第4天；D.類器官分離細(xì)胞第7天

2.4 細(xì)胞純化傳代培養(yǎng)

組織塊分離法獲得的細(xì)胞經(jīng)純化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)較好，但外形仍然存在梭形和多邊形，梭形部分較少(圖4A)，一般只能傳至5代。類器官分離的細(xì)胞連接更為緊密，形成明顯的“鋪路石”樣(圖4B)，且可以傳至8代以上。

A.組織塊分離純化得到的P3代細(xì)胞；B.類器官分離純化得到的P3代細(xì)胞

2.5 細(xì)胞生長曲線

2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞均在初期生長緩慢，可能是由于細(xì)胞剛剛開始貼壁生長，大約1 d后開始進(jìn)入快速生長期，60 h后，細(xì)胞數(shù)目趨于穩(wěn)定，增殖速度緩慢。兩種細(xì)胞的增殖速度相似，在60 h組織塊分離法獲得的細(xì)胞數(shù)目稍低于類器官分離的細(xì)胞數(shù)目，但并無較大區(qū)別(圖5)。

圖5 細(xì)胞生長曲線

2.6 細(xì)胞免疫熒光鑒定

對(duì)2種分離方法獲得的P3代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中存在特異性的角蛋白，而成纖維細(xì)胞不含有角蛋白[19-20]。DAPI染色下標(biāo)記的橢圓形細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，只顯示藍(lán)色者為成纖維細(xì)胞，藍(lán)綠色均顯示者為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。類器官培養(yǎng)法獲得的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞數(shù)量更多，純度更高，可達(dá)到95%以上。

A.組織塊分離獲得的細(xì)胞；B. 類器官分離獲得的細(xì)胞

3 討論

類器官的研究始于上世紀(jì)70年代，隨著荷蘭科學(xué)家Clevers及團(tuán)隊(duì)成功在體外構(gòu)建富含Lgr5+腸道干細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)即小腸類器官[21]，類器官已成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)。三維類器官培養(yǎng)是研究胚胎發(fā)育和疾病進(jìn)展的新型模型系統(tǒng)[22]，與單一細(xì)胞類型的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)相比，類器官可以作為研究發(fā)育、體內(nèi)平衡和再生的模型，能夠用于疾病建模，在器官水平上模擬病理[23]，也可用在藥物篩選、安全檢測等相關(guān)研究，是對(duì)于在體動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)的一個(gè)補(bǔ)充[24]。與Sugimoto等[25]培養(yǎng)組織類器官的培養(yǎng)相比較，本試驗(yàn)采用更加便捷、成本更低的方法嘗試類器官培養(yǎng)。通過比較不同月齡類器官，顯示4月齡胎牛更易獲得子宮類器官，可能是由于胎齡不同引起基因表達(dá)差異[26]，發(fā)育潛能不同，具體機(jī)制尚未了解，還需要更多的研究與驗(yàn)證。

目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者將目光集中到子宮內(nèi)膜的研究上，對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)主要采用組織塊分離法和酶消化法。組織塊分離法相對(duì)操作較為簡單，成本較低，能夠較為容易獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。但組織塊分離法培養(yǎng)所需時(shí)間較長，細(xì)胞容易重疊，出現(xiàn)空泡狀，且子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞交織生長[27]，組織塊分離培養(yǎng)的細(xì)胞不易純化，較難獲得高純度的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞[28]。酶消化法培養(yǎng)周期較短，但由于培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜組織來源不同、操作方法和溫度等因素影響，酶的消化時(shí)間并不統(tǒng)一，難以獲得穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。本試驗(yàn)曾采用胰酶消化法進(jìn)行相關(guān)培養(yǎng)，但難以控制消化時(shí)間，造成組織塊并未消化完全，待組織塊消化完畢后，在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)常出現(xiàn)大量細(xì)胞漂浮，造成試驗(yàn)成本增加。

類器官中含有多種細(xì)胞成分，因此試驗(yàn)嘗試通過培養(yǎng)的類器官分離子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。在類器官分離后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，48 h后即可觀察到組織塊已經(jīng)貼壁；96 h后形成以組織塊為中心，周圍有大量細(xì)胞向外延伸生長；第7天細(xì)胞鋪滿大部分瓶底，細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密，可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞的傳代與純化需要采用胰酶進(jìn)行消化，但消化時(shí)間有所差別。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞多來自牛子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞[29]，容易在培養(yǎng)過程中造成2種細(xì)胞交織在一起。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶耐受性的不同，選擇差時(shí)消化法進(jìn)行純化[20]。胰酶消化能力較強(qiáng)，大約2 min，即可在顯微鏡下觀察到大部分成纖維細(xì)胞懸浮變圓，而子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞消化所需時(shí)間較長，大約需要5 min才開始懸浮，因此，在3～4 min時(shí)，加入新的培養(yǎng)液終止消化，棄去，重新加入新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)待大部分細(xì)胞懸浮即可立即終止消化，一般需要5～6 min。隨著傳代次數(shù)的增加，胰酶對(duì)細(xì)胞的使用次數(shù)增多，細(xì)胞能夠?qū)σ让府a(chǎn)生耐受性，需要在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化懸浮狀態(tài)，根據(jù)懸浮情況調(diào)節(jié)消化時(shí)間。類器官分離細(xì)胞經(jīng)純化傳代后，形態(tài)明顯一致，呈“鋪路石”樣。

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)獲得的細(xì)胞制定生長曲線，細(xì)胞初期生長緩慢，中期快速生長，之后細(xì)胞鋪滿大部分瓶底，生長速度減慢，符合正常細(xì)胞的分裂特性，顯示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。最后，需要對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色最終鑒定。在免疫染色中使用標(biāo)記物是一種既定的方法，用于確定細(xì)胞類型。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞中的特異性蛋白，能夠作為子宮上皮細(xì)胞標(biāo)志物，鑒定上皮細(xì)胞[30]。通過使用角蛋白18抗體，對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，角蛋白18染色顯綠色，DAPI進(jìn)行核染顯藍(lán)色，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行整合，只有綠色和藍(lán)色熒光均顯示為上皮細(xì)胞，否則為基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示95%以上細(xì)胞為子宮內(nèi)膜細(xì)胞。

4 結(jié)論

通過胎牛子宮內(nèi)膜組織成功分離和培養(yǎng)胎牛子宮類器官，而且4月齡的胎牛子宮類器官出芽率更高。從類器官出芽組織成功分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，且相較于組織塊分離法周期較短、易于貼壁和純化，細(xì)胞純度更高，在體外培養(yǎng)時(shí)保持著較強(qiáng)的增殖活力。本試驗(yàn)為研究病毒、細(xì)菌、營養(yǎng)元素以及毒物等與子宮相互作用機(jī)理提供模型基礎(chǔ)。