賈偉娟，張玲艷，何云江，郗姍姍，王學(xué)理

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease, LSD)，又稱牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)疹，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒( lumpy skin disease virus, LSDV)引起的以病牛出現(xiàn)皮膚結(jié)節(jié)、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大和水腫為主要特征的急性、亞急性或慢性傳染病[1]。LSD暴發(fā)期間的發(fā)病率為3%～85%不等，而死亡率通常較低(1%～3%)，但幼年動物的死亡率可能高達40%～75%[2]。LSD導(dǎo)致的高發(fā)病率、不同程度的死亡率與其毒株類型、媒介流行程度、宿主的年齡和免疫狀態(tài)有關(guān)。該病可以導(dǎo)致牛皮永久性損傷、母牛流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降、公牛不育以及乳房炎等多種并發(fā)癥，對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

1 病原

LSDV是痘病毒科羊痘病毒屬的一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，該屬另外兩種病毒是綿羊痘病毒(sheeppox virus, SPV)和山羊痘病毒(goatpox virus, GPV)[4]。其基因組大小約為151 000 bp，是由中央的編碼區(qū)和兩端長為2.4 kb的倒置末端重復(fù)序列組成，編碼156個預(yù)測基因。LSDV與其他屬的痘病毒比較，有146個保守基因，編碼的蛋白與mRNA的合成及加工、DNA復(fù)制、病毒粒子的組裝、病毒的毒力和侵染宿主范圍有一定的關(guān)聯(lián)。在中央基因組區(qū)域，LSDV基因與其他已知的哺乳動物痘病毒，特別是豬痘病毒和山羊痘病毒的基因氨基酸同源性為65%左右。在末端區(qū)域，共線性被破壞，氨基酸同源性為43%左右。這些差異與影響病毒毒力和宿主范圍的功能基因及基因家族相關(guān)。雖然LSDV在基因和病毒結(jié)構(gòu)上與皰疹病毒相似，但它也含有其他痘病毒屬中發(fā)現(xiàn)的IL-10、IL-1結(jié)合蛋白、G蛋白偶聯(lián)CC趨化因子受體和表皮生長因子樣蛋白同源物。

由于環(huán)境的改變，病毒自身的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。有研究表明，俄羅斯庫爾干地區(qū)在2018年出現(xiàn)了新的變種LSDV病毒。研究發(fā)現(xiàn)，分離株的主鏈基因構(gòu)成穩(wěn)定，側(cè)鏈基因發(fā)生了較大改變，共27個重組位點，證實該分離株屬于類疫苗重組株[5-6]。

LSDV可以在羔羊、犢牛腎細胞和綿羊胚胎腎細胞等原代細胞，以及非洲綠猴腎細胞等傳代細胞中增殖并產(chǎn)生細胞病變。感染的細胞培養(yǎng)物用蘇木素-伊紅或蘇木素-玫瑰紅染色，組織學(xué)觀察可見細胞胞漿內(nèi)有包涵體。在雞胚絨毛尿囊膜上生長繁殖可引起痘斑，且雞胚不死亡。病毒在55 ℃ 2 h或65 ℃ 30 min的環(huán)境下失去活性，不耐強酸、強堿，對乙醚和甲醇敏感，在正常環(huán)境溫度下可以較長時間存活，在皮膚痂皮中存活時間長達40 d以上。

2 流行病學(xué)

牛是LSDV的自然宿主，各個年齡段和品種的牛都具有易感性。該病的發(fā)生呈季節(jié)性，5月份發(fā)病率較低，10月份發(fā)病率最高。不同地區(qū)的發(fā)病率不同，在炎熱干燥的低海拔地區(qū)發(fā)病率較低，反之在溫暖潮濕的高原地區(qū)則發(fā)病率較高[7]。2015年，該病在埃及的發(fā)病率為8.7%，死亡率為0.4%，而在土耳其發(fā)病率為12.3%，死亡率為6.4%[8]。

2.1 LSD發(fā)展史

1929年，LSD在贊比亞首次被報道，隨后傳播到蘇丹和南部非洲國家，之后非洲之角暴發(fā)了很嚴重的疫情，導(dǎo)致LSD在非洲成為牛的常發(fā)疫病。1944 年，南非德蘭士瓦省發(fā)生 LSD疫情，由于沒有受到足夠的重視，導(dǎo)致其在3年時間內(nèi)演變成暴發(fā)性的大流行，總共感染800 多萬頭牛，這是目前 LSD 造成危害最為嚴重的一次大流行。1974年，尼日利亞報道了LSD；1976年該病傳入象牙海岸，此后在非洲大陸一直呈周期性暴發(fā)。1977年利比里亞共和國和加納共和國均報道了該病的發(fā)生。1981年，埃塞俄比亞首次出現(xiàn)LSD疫情。1986年該病傳播到中東地區(qū)，直到2012年之前中東地區(qū)僅出現(xiàn)零星的少量LSD感染病例。2012年夏天，在以色列靠近敘利亞邊界的戈蘭高地北部發(fā)生了LSD。2012年，LSD在以色列北部開始蔓延。2012年末，黎巴嫩出現(xiàn)34起LSD疫情。隨后，在約旦和約旦河西岸也有該病的發(fā)生。2013年，LSD在土耳其全境開始傳播[9]。從2014—2015年，該病擴大到歐洲東南部和東北部，影響到高加索國家和哈薩克斯坦[10]。2015—2016年間，依次傳播到俄羅斯、希臘、亞美尼亞、保加利亞和馬其頓共和國[11]。2019年8月，我國在新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州首次發(fā)現(xiàn)牛結(jié)節(jié)性皮膚病，2020年，我國已將其列為一類傳染病[12]。隨著疫病的傳播和蔓延，該病逐漸威脅到其他亞洲國家和歐洲國家。

2.2 傳播媒介和傳播途徑

LSD最主要的傳染源是病牛，其傳播媒介尚不完全清楚，一直以來都認為節(jié)肢動物是最主要的傳播媒介。

Sohier等[13]通過試驗研究了廄螯蠅(Stomoxyscalcitrans)與麻虻屬昆蟲(Haematopotaspp.)是否可以將LSDV從感染牛傳播給易感牛。首先給14頭健康牛頸靜脈注射LSDV，待出現(xiàn)病毒血癥或牛皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)時用其血喂養(yǎng)這兩種吸血昆蟲。之后，2種昆蟲以叮咬方式感染14頭易感牛， 42 d后對易感牛進行剖檢。對易感牛血液、組織器官以及吸血昆蟲進行實時PCR分析。結(jié)果表明，30%的易感牛血液與組織器官呈陽性，52%的吸血昆蟲LSDV檢測呈陽性，說明廄螯蠅和麻虻屬昆蟲可以通過叮咬吸血將LSDV間接傳播給易感牛。

Chihota等[14]給健康牛攻毒，通過埃及伊蚊(Aedesaegypti)吸食其血液后再去叮咬易感牛。結(jié)果顯示，參與實驗的6頭易感牛中5頭出現(xiàn)LSD臨床癥狀，其中4頭表現(xiàn)為被叮咬部位腫脹以及局部淋巴結(jié)腫大；1頭發(fā)熱并出現(xiàn)結(jié)膜炎、鼻炎，同時被叮咬部位發(fā)生腫脹并形成直徑約3 cm的結(jié)節(jié)。15 d之后，已出現(xiàn)結(jié)膜炎和鼻炎的牛在被叮咬部位周圍又發(fā)現(xiàn)3個新的結(jié)節(jié)，最先出現(xiàn)的結(jié)節(jié)發(fā)展成潰瘍并結(jié)痂。從所有易感牛被毛中分離病毒并進行PCR檢測，結(jié)果表明被毛中均檢測到了LSDV，雖然參與試驗的6頭易感牛中有1頭牛并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但在其被毛中也檢測到了病毒的存在，表明埃及伊蚊參與了LSDV在牛群之間的傳播。因此，在傳播媒介活躍的季節(jié)適當限制牛群活動，可以有效減少傳播媒介與易感動物的接觸，降低該病的發(fā)病率。

Rouby等[15]在一頭母牛產(chǎn)下的犢牛身上觀察到了類似LSD的皮膚病變，這頭母牛在妊娠7個月的時候曾出現(xiàn)LSD癥狀。產(chǎn)下的犢牛虛弱、口腔黏膜充血并伴有呼吸窘迫，36 h后出現(xiàn)死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)犢牛全身不同部位以及臟器均有大小不等的結(jié)節(jié)。PCR檢測結(jié)果顯示LSDV呈陽性，表明LSDV可以通過妊娠期母牛垂直傳播給胎牛。

深入了解LSDV的傳播機制和媒介的作用，才能有針對性地預(yù)防該病的發(fā)生，有助于在該病發(fā)生早期及時采取有效的手段切斷傳播途徑，控制疾病的流行，從而防止大規(guī)模傳播，減少經(jīng)濟損失。

3 臨床癥狀和病理變化

3.1 臨床癥狀

LSD最明顯的臨床特征是病牛的頭部、頸部、會陰、乳房、乳頭等皮膚表面出現(xiàn)特征性皮膚結(jié)節(jié)，大多數(shù)結(jié)節(jié)壞死，結(jié)痂。皮膚結(jié)節(jié)最初是略微隆起、堅硬、微紅，逐漸發(fā)展成為直徑達3～5 cm的隆起、堅硬、邊界清楚的結(jié)節(jié)，1～2周后，形成干燥的暗紅色至黑色凹陷的中央壞死區(qū)。少數(shù)結(jié)節(jié)外觀呈靶狀，紅色中心直徑小于0.5 cm，周圍有直徑達1 cm的淺粉色變色區(qū)，外周有一條界線清晰的暗紅線，靶樣病變保持平坦，最終變?yōu)樯钭厣蚝谏玔16]。此外，受感染的動物還表現(xiàn)出抑郁、食欲不振、流產(chǎn)、流膿性鼻液、流涎、眼角膜渾濁并伴有肺炎和乳腺炎等多種并發(fā)癥，最后導(dǎo)致無法站立[17-18]。嚴重感染的病牛四肢和頭部水腫，產(chǎn)奶量明顯下降。同時病牛體溫升高、脈搏和呼吸頻率也明顯加快，導(dǎo)致病牛呼吸急促、精神不振[19]。

3.2 病理變化

剖檢可見患牛心臟腫大，心肌外表充血、出血，呈現(xiàn)斑塊狀瘀血；肝臟腫大，邊緣鈍圓；膽囊腫大，為正常膽囊的2～3倍，外壁有出血斑點和斑塊；脾臟腫大、質(zhì)地變硬，有出血狀況；肺臟腫大，有少量出血點。腎臟表面有出血點，胃黏膜出血，小腸彌漫性出血，淋巴結(jié)腫大、出血，腫塊周邊呈膠凍樣浸潤[20]。

皮膚結(jié)節(jié)病理組織學(xué)檢查顯示，結(jié)節(jié)上完整的表皮出現(xiàn)氣球樣變性，形成微囊泡和嗜酸性胞漿內(nèi)涵體。幾乎所有的真皮血管壁都增厚、壞死，呈現(xiàn)壞死性血管炎。此外，壞死和炎性細胞浸潤還延伸到血管周圍皮下組織[21]。表皮水腫、充血、嚴重水樣變性和過度角化，壞死組織周圍有大量組織細胞和成纖維細胞，淋巴結(jié)嚴重水腫和中性粒細胞浸潤。氣管黏膜表面有出血點。睪丸組織水腫，有淡黃色膠狀滲出物和出血點[22]。

4 診斷

4.1 病原學(xué)診斷

取患病動物的皮膚結(jié)節(jié)與組織臟器進行研磨，制成混懸液。將混懸液滴在蠟板上，1 min后加入1滴pH=7.8的Tris/EDTA buffer溶液，20 s 后再加入1滴pH=7.2的10 g/L的磷鎢酸溶液，10 s后，吸干多余的染色液，使用透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)[23-24]。

4.2 血清學(xué)診斷

常見的血清學(xué)檢查方法主要為酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗(VNT) 和凝集試驗(AT)。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦前4種試驗方法作為標準血清學(xué)檢測方法。但是到目前為止，OIE認定的標準檢測方法是VNT，該方法具有高特異性和良好的敏感性，減少了高通量技術(shù)的應(yīng)用。由于使用VNT處理活病毒時，不可以在常規(guī)實驗室內(nèi)進行，由此其應(yīng)用可能面臨限制[25]。IFAT具有與牛丘疹性口炎病毒和其他痘病毒抗體交叉反應(yīng)增強的缺點。與上述血清學(xué)方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)被認為更適合于大規(guī)模有效的免疫學(xué)研究。但是，目前建立LSD特異性抗體ELISA檢測方法的研究較少。

4.3 分子生物學(xué)診斷

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，基于TaqMan探針的實時PCR、TaqMan-MGB熒光PCR、重組酶聚合酶鏈反應(yīng)(RPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)、免疫過氧化物酶單層分析法(IPMA)等技術(shù)逐漸滿足了科研人員對LSDV診斷檢測的要求。

Alexander等[26]創(chuàng)建了一種TaqMan實時PCR檢測LSDV的方法。該方法是基于LSDV044靶基因設(shè)計的，該靶基因具有特異性的識別位點，便于對分離株進行敏感性和特異性的檢測。結(jié)果顯示，對5個數(shù)量級的擴增效率為93%，標準偏差保持在0.11～0.23的范圍內(nèi)，對3個不同日期的重復(fù)測定的變異范圍在0.83～1.22。是一種不需要考慮基因型，可在常規(guī)實驗室操作的快速、有效、靈敏的工具，適用于基礎(chǔ)研究或應(yīng)用監(jiān)測研究。聶福平等[27]參照GenBank中發(fā)表的LSDV全基因組序列，設(shè)計并合成一對特異性引物和探針，經(jīng)條件優(yōu)化，建立了可鑒別LSDV的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測 LSDV，而且與山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛痘病毒和豬痘病毒均無交叉反應(yīng)，最低檢出下限為1.48 copies/μL；組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于2%。使用該方法對52份模擬臨床樣品進行檢測，結(jié)果有32份模擬臨床樣品檢測出LSDV核酸陽性，而普通PCR只檢測出28份陽性模擬臨床樣品。表明該熒光定量 PCR的敏感性明顯優(yōu)于普通PCR，能夠快速準確地檢測LSDV，適用于臨床樣品的檢測。Agianniotaki等[28]建立了一種針對G蛋白偶聯(lián)受體基因(GPCR基因)的雙定量實時PCR方法，用于檢測和鑒別LSDV的野毒株和疫苗株。對野毒株和疫苗株的擴增效率分別為91.3%和90.7%，最低檢測均為8個DNA片段，變異系數(shù)分別為0.3%和0.73%，可對疑似病例進行確診，能將野毒感染動物與疫苗感染動物區(qū)分開來，可以作為疫苗接種中有效的檢測工具。

基于PCR在成本、時間和設(shè)備方面的復(fù)雜性，Mwanandota等[29]建立了環(huán)介導(dǎo)異等溫擴增技術(shù)(LAMP)，在病牛中檢出率為39%，而PCR檢出率則為13.6%，最低檢出限為8 copies/μL，且與其他病毒無交叉反應(yīng)，表明與PCR相比，此方法的靈敏度更強，特異性更高，是一種簡便、經(jīng)濟有效的檢測方法，在常規(guī)診斷中使用更為快捷。Shalaby等[30]建立了檢測LSDV的重組酶聚合酶鏈反應(yīng)(RPA)方法，檢測溫度為42 ℃，最長15 min可檢測到179個DNA片段。12份LSDV陰性樣品和口瘡(Orf)病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛痘病毒、小反芻獸疫病毒和藍舌病毒(血清型1、6和8型)的核酸樣品均未觀察到非特異性擴增；檢測的臨床敏感性與實時PCR結(jié)果一致，可在現(xiàn)場或檢疫站用于LSDV感染病例的鑒定，是一種簡便、快速的檢測方法。Haegeman等[31]建立了一種新的檢測LSDV抗體的免疫過氧化物酶單層分析法(IPMA)，使用2種稀釋濃度(1∶50和1∶300)驗證該方法的可用性，結(jié)果顯示，使用最低稀釋濃度即可區(qū)分藍舌病毒、口蹄疫病毒和LSDV；使用最高稀釋濃度在感染后第8和15天檢測，靈敏度分別為56.7%和100%。該方法也適用于SPV和GPV，表明其具有高度敏感性、特異性、靈活性和重復(fù)性，與商品化ELISA相比，該方法能夠更早的在感染和接種動物中檢測到LSDV抗體，且可以在低生物安全實驗室操作。

常規(guī)的PCR檢測方法靈敏快速，但是需要將病毒進行分離才能檢測病原；LAMP分析需要4～6個寡核苷酸和至少4個結(jié)合位點，大約需要60 min才可讀出結(jié)果；相反，RPA檢測方法則十分快速，只需要2個引物和1個探針，在15 min內(nèi)即可出現(xiàn)結(jié)果。IMPA雖具有高度敏感性、特異性和重復(fù)性，可該方法在使用過程中會耗費大量時間和人力，同時需要較高的成本。而特定的TaqMan檢測方法，由于操作簡單，高通量，敏感性和特異性強，最適合進行實驗室診斷時使用。

5 防控措施

2020年，我國在進境動物檢疫疫病名錄中將其列為一類傳染病，到目前為止，還沒有針對LSD特別有效的治療方法[32]。

國外對于LSD采取的防控措施主要是疫苗接種與撲殺患病動物相結(jié)合來防止疾病蔓延。埃塞俄比亞出現(xiàn)疫情后，立即實行疫苗接種計劃、撲殺患病動物并限制牲畜流動，有效的控制了該病的傳播。土耳其在無疾病地區(qū)對來自疫區(qū)的牲畜、獸皮和精液進行了嚴格的控制[33]。印度則使用誘捕器、殺蟲劑捕殺蚊、蠅、虻等媒介昆蟲，來預(yù)防該病[34]。

國內(nèi)對LSD預(yù)防的最佳方法是提前對高風險地區(qū)的牛群進行疫苗免疫，由于SPV和GPV疫苗株對LSDV 會產(chǎn)生部分交叉保護性，所以可以通過接種GPV疫苗來預(yù)防LSDV。對疫區(qū)的易感動物采取定期驅(qū)蟲和消滅蟲媒等措施以防止疾病發(fā)生擴散。同時在疫區(qū)要禁止放牧，并嚴格控制對牛群的調(diào)運。對于疑似LSD的病牛要立即向當?shù)赜嘘P(guān)部門上報并及時將鼻拭子和痂皮等樣品送檢，將可疑病牛進行隔離，限制移動。一旦被確診為LSD立即將所有病牛進行撲殺，采取深埋等無害化處理。對病牛所在縣及其鄰近縣所有牛采用5倍劑量的GPV疫苗進行緊急免疫，并對養(yǎng)殖場進行嚴格徹底的消殺。

6 結(jié)語

目前LSD對于我國來說屬于新發(fā)的疫病，會危害牛以及其他野生動物。該病的發(fā)生引起了全球的廣泛關(guān)注，不僅對養(yǎng)牛業(yè)造成經(jīng)濟損失而且還會給國際貿(mào)易帶來一定的影響。因此，加強該病的防控顯得極為重要。

基于LSDV與GPV和SPV同屬，同源性極高，可以使用SPV弱毒活疫苗和GPV弱毒活疫苗進行免疫，但是要特別注意野毒株與疫苗株在體內(nèi)重組的情況，一旦發(fā)生重組可能會產(chǎn)生毒力更強的新毒株[35]。因此，候選疫苗的安全性評估不容忽視。目前，對LSD的致病機制、傳播途徑和傳播媒介尚不完全清楚，仍需相關(guān)機構(gòu)做進一步的深入研究，我國已經(jīng)出現(xiàn)LSD病例，所以研發(fā)安全高效的疫苗迫在眉睫，應(yīng)以疫苗的創(chuàng)新性、安全性和有效性作為研發(fā)的重點，以用于該病的預(yù)防和根除。

隨著我國與世界各國之間的貿(mào)易往來越來越密切，應(yīng)嚴格加強口岸動物疫病的監(jiān)督和管理。各級獸醫(yī)部門應(yīng)加大排查力度，及早進行LSD疫苗免疫接種，避免因疏于管理而造成疫情大暴發(fā)和擴散，造成不可挽回的損失。