鐘登科，李尚同，張俊杰，秦愛建

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

蓋塔病毒(Getah virus，GETV) 是一種由吸血節(jié)肢動物傳播的單股線狀RNA病毒，屬披膜病毒科(Togaviridae) 甲病毒屬(Alphavirus)成員[1-2]，該病毒可以引起豬的流產(chǎn)、馬的發(fā)熱皮疹和淋巴結(jié)腫大[3-5]。此外該病毒也感染人類，一些研究表明在馬來西亞、澳大利亞和中國的健康人和發(fā)熱患者的血清標(biāo)本中檢測到GETV中和抗體[5-7]。

1955年首次在馬來西亞的雪背庫蚊中分離到GETV MM2021株[8]。至今已陸續(xù)在日本、澳大利亞、中國、蒙古國和俄羅斯等13個國家或地區(qū)的蚊媒和發(fā)病動物(馬或豬)的組織或血液中分離到GETV[9]。我國于1964年首次在海南蚊媒中分離到GETV M1株[10]，以后陸續(xù)在中國多個省市的蚊媒和動物樣品中檢測并分離到多株GETV。本研究對2018年7月采集自上海市浦東新區(qū)和奉賢區(qū)馬場的蚊子樣品進(jìn)行檢測，從中華按蚊、三帶喙庫蚊樣本中成功分離得到2株GETV，命名為SH201801、SH201802。對其E2蛋白的基因序列進(jìn)行測定和分析，了解分離株的遺傳變異情況，以期為上海地區(qū)GETV感染的防控提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

白蚊伊蚊卵細(xì)胞(C6/36)和金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所傳代保存。蚊媒樣品是于2018年7月18:00至次日6:00采用利用紫外捕蚊燈在上海市浦東新區(qū)和奉賢區(qū)多個馬場采集的蚊蟲，共捕獲成蚊6 864只。QIAampR Virus RNA Mini Kit購自Qiaqen公司；兔抗GETV E2蛋白多克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員饋贈，熒光素標(biāo)記羊抗兔抗體(FITC-IgG)購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參考GenBank中GETV SH05-6株(EU015066.1)的結(jié)構(gòu)蛋白E2核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計GETV特異性引物GETV-F：5′-AAGTGCCATGCACAACGTACC-3′/GETV-R：5′-GGCGAACATGTAACATGACGCC-3′和E2基因全長引物E2-F：5′-AGTGTGACGGAACACTTCAATGTCTAC-3/E2-R：5′-GGCATGCGCTCGTGGT-3′，由上海生工合成。

1.3 樣本處理與病毒分離

參考文獻(xiàn)[10]對捕獲的蚊媒進(jìn)行形態(tài)鑒定和分類計數(shù)，選取雌蚊用PBS進(jìn)行研磨，12 000 r/min離心8 min，無菌過濾后將濾過液分別接種于單層C6/36細(xì)胞或BHK-21細(xì)胞，依次盲傳5代，并設(shè)正常細(xì)胞對照組。每天觀察細(xì)胞的病變情況，當(dāng)約70%細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲細(xì)胞、離心后收獲上清液于-80 ℃凍存。

1.4 RT-PCR鑒定

取細(xì)胞培養(yǎng)上清液使用QIAamp病毒基因組提取試劑盒按照操作說明書提取病毒RNA，利用SuperScriptTMⅢ AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以2 μL cDNA為模板，上、下游引物各0.5 μL，PCR酶Mix 10 μL，DEPC水7 μL，混勻后置于PCR儀中擴增。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，擴增40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。選取陽性產(chǎn)物送至上海生工測序。

1.5 間接免疫熒光(IFA)鑒定

參考文獻(xiàn)[3]對分離株進(jìn)行IFA鑒定。

1.6 序列測定與分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后，連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用藍(lán)白斑篩選，選擇白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)后，送檢測序，序列測定后在GenBank中下載GETV參考病毒的E2基因核苷酸序列，使用MegAlign軟件完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析，并繪制基于Neighbor-joining(NJ)法的系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究中引用的GETV毒株序列信息如下：AH9192(MG865965)、DY0824(KY434328)、DH10M1105(KY450689)、GETV-GDFS2-2018(MT086508)、GETV-V1(KY399029)、GS10-2(EU015070)、GX201808(MT269657)、GZ201808(MK487997)、GZ0881(KY457548)、GZ0862(KY457546)、HNNY-1(MG865966)、HuN1(MF741771)、JL1708(MG869691)、JL1808(MH722256)、JS18(MT210319)、LEIV 16275 Mag(EF631998)、LEIV 17741 MPR(EF631999)、M1(EU015061)、MM 2021(AF339484)、SC201807(MK693225)、SD1709(MH106780)、SH05-6(EU015066)、SH05-16(EU015068)、SC1210(LC107870)、YN0542(EU015064)、YN12031(KY434327)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變觀察

采集自上海市浦東新區(qū)和奉賢區(qū)馬場的蚊子經(jīng)鑒別分類，統(tǒng)計如下：雄蚊664只(9.67%)、雌蚊6 200只(90.33%)，包括三帶喙庫蚊5 960只(96.13%)、中華按蚊188只(3.03%)、其他蚊種52只(0.84%)。選取雌蚊，每100只蚊子研磨成一個樣品。

經(jīng)過連續(xù)5次盲傳，所有樣品在C6/36細(xì)胞上沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變，僅從其中的中華按蚊、三帶喙庫蚊2個陽性樣品在BHK-21細(xì)胞第4次傳代后出現(xiàn)細(xì)胞病變。與正常的BHK-21細(xì)胞相比較，接種陽性培養(yǎng)物的細(xì)胞在感染72 h左右開始出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、皺縮、變圓，并大面積脫落，第6天細(xì)胞完全脫落。

2.2 RT-PCR鑒定

提取2個病變的細(xì)胞上清總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特異性引物GETV-F/GETV-R和E2基因全長引物E2-F/E2-R對2個陽性培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定并擴增GETV的E2基因，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，2個陽性培養(yǎng)物均出現(xiàn)了約718 bp和1 200 bp的條帶，與預(yù)期相符合(圖1)，初步證實2個陽性培養(yǎng)物為GETV陽性，命名為SH201801、SH201802。

1～2. 全長E2基因；4～5. E2基因特異片段；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 3，6. 陰性對照

2.3 IFA鑒定

與未接毒細(xì)胞相比，感染GETV分離株SH201801和SH201802的細(xì)胞均出現(xiàn)特異性的綠色熒光，主要集中在胞漿中(圖2)，可進(jìn)一步鑒定SH201801株、SH201802株為GETV。

A. SH201801株感染的BHK-21細(xì)胞; B. SH201802株感染的BHK-21細(xì)胞;C. 未感染的BHK-21細(xì)胞

2.4 序列分析

E2蛋白是GETV誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要結(jié)構(gòu)蛋白[11]。采用DNAStar軟件將浦東新區(qū)和奉賢區(qū)多個馬場采集的蚊蟲分離的GETV SH201801株和SH201802株的E2基因與從GenBank中選擇的33株GETV的E2基因進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示，SH201801株和SH201802株間核苷酸同源性為99.3%氨基酸同源性為100.0%。SH201801株與上海庫蚊源分離株SH05-16的核苷酸同源性最高，為99.8%，氨基酸同源性為100.0%；與馬來西亞原始株MM2021的核苷酸同源性最低，為93.6%，氨基酸同源性為96.9%。SH201802株與上海庫蚊源分離株SH05-6的核苷酸同源性最高，為99.9%，氨基酸同源性為100.0%；與馬來西亞原始株MM2021的核苷酸同源性最低，為94.2%，氨基酸同源性為96.9%。GETV的E2基因有1 266個核苷酸編碼422個氨基酸的病毒包膜糖蛋白。GETV SH201801株和SH201802株與馬來西亞原始株MM2021有12個氨基酸差異位點，與國內(nèi)首個分離株M1有5個氨基酸差異位點(表1)。

表1 GETV分離株E2蛋白氨基酸序列位點與參考毒株的差異

以E2基因為基礎(chǔ)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，其中包括涵蓋1955—2018年的病毒分離株(中國23株，俄羅斯、蒙古和馬來西亞各1株)，毒株分離年代，宿主包括蚊、豬和馬。28株病毒被分成3大分支，GETV SH201801株和SH201802株分別與以往的上海分離株SH05-16、SH05-6位于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，與進(jìn)化分支的根部馬來西亞原始株MM2021的親緣性較遠(yuǎn)。SH201801株和SH201802株屬于Group Ⅲ GETV。

?本研究分離毒株

3 討論

自1955年在馬來西亞首次從庫蚊中分離出GETV以來，先后在日本、澳大利亞、中國和韓國等13個國家或地區(qū)從多種蚊蟲和馬匹以及豬樣品分離到約50株GETV。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GETV可以引起馬匹和豬的疾病，感染馬匹后可引起短暫的發(fā)熱、皮疹和腿部水腫[4]，感染豬只后可引起發(fā)熱、厭食癥、抑郁和腹瀉，并可導(dǎo)致胎兒死亡和生殖障礙[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)該病毒也可以感染人類[6-7]。

蚊類是GETV的重要傳播媒介。上海屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，蚊種多樣性豐富，適宜溫濕度給蚊蟲孳生創(chuàng)造了條件。同時上海作為我國重要的商貿(mào)口岸城市，國際交流頻繁，為蚊媒病毒的傳播提供了機會。目前已經(jīng)在4屬9種蚊蟲(三帶喙庫蚊、中華按蚊、偽雜鱗庫蚊、環(huán)帶庫蚊、棕頭庫蚊、刺擾伊蚊、白紋伊蚊、雪背庫蚊和阿蚊)中分離到GETV[9-10,12-13]。本研究從上海市浦東新區(qū)和奉賢區(qū)馬場采集的中華按蚊、三帶喙庫蚊樣本中成功分離得到2株GETV，豐富了上海地區(qū)的GETV傳播媒介。

GETV E2基因編碼病毒囊膜蛋白，是病毒與宿主細(xì)胞受體互作的重要膜蛋白，也是主要的抗原蛋白[11]。E2基因全長均為1 266 bp，編碼422 aa[2]。本研究的分離株SH201801和SH201802與上海以往的庫蚊源分離株SH05-16、SH05-6的氨基酸序列沒有差異，但與馬來西亞原始株MM2021有12個氨基酸差異位點，與國內(nèi)首個分離株M1有5個氨基酸差異位點(表1)。根據(jù)E2基因進(jìn)行遺傳演化分析，可將GETV分為3個不同的群，本研究的分離株SH201801和SH201802與我國大多數(shù)毒株親緣關(guān)系較近，均屬于GroupⅢ[14]，表明國內(nèi)GETV 分離株E2基因較為保守；但與馬來西亞原始株MM2021和俄羅斯伊蚊分離株LEIV 16 275的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明GETV經(jīng)過50多年的進(jìn)化，出現(xiàn)了一定的變異[14]。

綜上，本研究從上海市浦東新區(qū)和奉賢區(qū)馬場采集的中華按蚊、三帶喙庫蚊樣本中成功分離得到2株GETV，豐富了上海市GETV的傳播媒介，有利于了解上海市馬場蚊源GETV的分子生物學(xué)特征。目前關(guān)于GETV致病機制尚未清楚，因此深入開展GETV感染的流行病學(xué)和致病機制的研究具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。