馮亮 劉益慶

（1 江蘇省東海縣產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥理室 江蘇 連云港 222300）

（2 連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥理室 江蘇 連云港 222000）

美司鈉注射液為預(yù)防環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氯環(huán)磷酰胺等藥物的泌尿道毒性[1]?，F(xiàn)有的該品種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)“中國(guó)藥典”2015年4期9301版“注射安全檢驗(yàn)方法應(yīng)用指南”[2]。有必要對(duì)該品種建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法快速，敏感，準(zhǔn)確，符合3R原則[3-4]，逐步取代兔熱原試驗(yàn)方法。本研究建立了美司注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，大大提高了臨床用藥的安全性。

1.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201885，效價(jià)：80EU/支)；鱟試劑(TAL，湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：0.1mL/支，批號(hào)：1710162，靈敏度：0.25EU·mL-1；湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格：0.1mL/支，批 號(hào)：1711092，靈敏度：0.25EU·mL-1)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，中國(guó)食品藥檢監(jiān)督檢定研究院，規(guī)格：5mL/支，批號(hào)：160006-201704；美司鈉注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：170126，規(guī)格：4ml：0.4g ；批號(hào)170312,規(guī)格：4ml：0.4g；批號(hào)170617，規(guī)格：4ml：0.4g）；儀器ZH-2BLENDER型旋渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；MET-50 型智能恒溫儀(天大天發(fā)科技有限公司)；GZX-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

2.方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑敏感性檢查

根據(jù)中國(guó)藥典，2015年版四部通則1143，鱟試劑敏感性試驗(yàn)[5]，所測(cè)試的鱟試劑的靈敏度值均在0.5λ至2.0λ的范圍內(nèi)，符合要求，見(jiàn)表1。

表1 鱟試劑敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 樣品內(nèi)毒素限制L的確定

細(xì)菌內(nèi)毒素限量公式L=K/M，其中K是每人每公斤體重最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5EU·(kg·h)-1；每千克體重用于人體的M以小時(shí)計(jì)的最大劑量。

對(duì)照用藥說(shuō)明書(shū)，該藥的常用劑量為20%環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，氯磷酰胺劑量，靜脈滴注或靜脈滴注，給藥時(shí)間為0小時(shí)（與細(xì)胞抑制劑同時(shí)），4小時(shí)后和8小時(shí)后，兒童的給藥頻率應(yīng)相對(duì)較頻繁（例如6次），間隔時(shí)間較短（例如3小時(shí)）。

根據(jù)環(huán)磷酰胺注射規(guī)范，成人常用量：?jiǎn)嗡庫(kù)o脈注射體表面積500～1000mg/m2，加生理鹽水20～30ml，靜脈注射，每周一次，每次2次，休息1～2周，重復(fù)。人的體表面積按1.62m2計(jì)，注射用環(huán)磷酰胺最大劑量27mg/kg，美司鈉注射液最大劑量5.4mg/kg，K=5EU/Kg，L=K/M=5EU/Kg/5.4 mg/Kg=0.926EU/mg，由于該藥為聯(lián)合用藥，可嚴(yán)格至限值的1/2或者1/3，因此，限制設(shè)定為0.3EU·mL-1[6]。

2.3 干擾測(cè)試預(yù)實(shí)驗(yàn)

凝膠法用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。鱟試劑的靈敏度為0.03～0.5 EU·mL-1，L=0.3EU·mL-1，試驗(yàn)樣品用 BET 水制成 60,120,240,500，1000倍系列濃度的溶液，并將獲取的溶液作為試驗(yàn)溶液（NPC），制備一系列含有2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的各稀釋比的試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照溶液（PPC）。使用鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，敏感度為0.25EU/mL-1。從表2中初步確定，三批Mesna注射液稀釋60倍，不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)，見(jiàn)表2。

表2 美司鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 正式干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)測(cè)試結(jié)果，從不同批次中取出三批測(cè)試樣品，并用BET水稀釋1：60倍作為測(cè)試溶液。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)分別由試驗(yàn)溶液和BET水制成,使用濃度為2λ、λ、0.5λ和0.25λ的溶液，兩種不同制造商生產(chǎn)的靈敏度為0.25 EU·mL-1。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則 1143細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)?zāi)z法干擾試驗(yàn)操作。不同批次的TAL和WSE反應(yīng)之間沒(méi)有干擾,Mes注射鈉以1：60稀釋?zhuān)?jiàn)表3。

表3 美司鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)建立

根據(jù)上述結(jié)果，可以建立美司鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌內(nèi)毒素：取本品并依法檢查(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則 1143)，每1mg美司鈉的內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.3EU。

2.6 樣品檢測(cè)

根據(jù)本研究中建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，取鱟試劑，靈敏度為0.25EU·mL-1。常規(guī)檢查三批美司鈉注射液，結(jié)果符合規(guī)定。見(jiàn)表4。

表4 美司鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果表

3.討論

美司鈉注射液常用量為環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氯磷酰胺劑量的20%，由于是聯(lián)合用藥，所以在限值上需要嚴(yán)格控制，期間根據(jù)注射用環(huán)磷酰胺和注射用異環(huán)磷酰胺的說(shuō)明書(shū)，得出的理論限值為：注射用環(huán)磷酰胺＜注射用異環(huán)磷酰胺，所以選用注射用環(huán)磷酰胺的理論限值，最終確定為L(zhǎng)=0.3EU·mL-1。

在干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)美司鈉注射液幾乎不存在干擾作用，所以選擇最小的稀釋倍數(shù)（1：60）作為干擾試驗(yàn)的濃度進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。

由于該藥的標(biāo)準(zhǔn)既沒(méi)有細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)又沒(méi)有熱原檢查項(xiàng)，所以可以在兩者之間隨便選擇一項(xiàng)作為檢查項(xiàng)，綜合各種條件考慮，最終還是選擇細(xì)菌內(nèi)毒素較為妥當(dāng)。

查詢(xún)文獻(xiàn)，沒(méi)有找到美司鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，該文建立的細(xì)菌內(nèi)毒方法為：取本品并依法檢查(《中國(guó)藥典》2015 年版四部 1143)，每1mg美司鈉的內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.3 EU。