劉 咪 朱 靜 陳佳欣 丁慧霞 高 迎姜文君 袁 坤 董 欣 陳 磊*

(1.曲阜師范大學生命科學學院，曲阜，273165；2.濟南野生動物園，章丘，250200)

雪豹(Pantherauncia)是青藏高原及中亞山地生態(tài)系統(tǒng)的旗艦物種，通常分布在海拔3 000 m以上的區(qū)域，是雪豹屬的唯一代表。由于食物缺乏、棲息地退化和人為干擾，雪豹的種群數(shù)量持續(xù)下降。由于野生雪豹行蹤詭秘，種群監(jiān)測困難，現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)較少。已有學者圍繞雪豹的行為[1]、食性[2]、棲息地[3]和種群恢復(fù)等領(lǐng)域展開研究[4]，另有少數(shù)關(guān)于雪豹繁殖生理學[5]和分子生態(tài)學領(lǐng)域的研究報道[6-7]。

腸道微生物是宿主食物消化和腸道免疫中不可或缺的部分[8]，在為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時，可以激活宿主腸道免疫系統(tǒng)，幫助宿主抵抗病原體的侵襲[9]。食肉動物的食物中通常含有大量的動物組織，為腸道微生物提供了可用于發(fā)酵的底物[10-11]。在某些功能菌群的幫助下，一些難以消化的食物可以轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)[12]。因此，探討食肉動物腸道微生物多樣性可以更好地分析腸道微生物在食肉動物的食物資源利用中的功能貢獻。貓科(Felidae)動物是典型的食肉動物，Ritchie等較為系統(tǒng)地描述了家貓的腸道微生物多樣性特征[13-15]，但是對野生貓科動物腸道微生物的研究較少[16-21]。Zhang等和劉廣帥通過利用第一代測序技術(shù)初步研究了雪豹糞便微生物群落的組成和多樣性特征[22-23]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，大批量測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出為深入、完整地了解雪豹腸道微生物的多樣性奠定了基礎(chǔ)[24]。已有學者借助高通量測序技術(shù)對獵豹(Acinonyxjubatus)、東北虎(Pantheratigrisaltaica)、金錢豹(Pantherapardus)等野生貓科動物的腸道微生物多樣性進行了研究[25-28]，然而，關(guān)于雪豹腸道微生物高通量測序的研究尚未見報道。

本文首次利用高通量測序技術(shù)對雪豹腸道微生物多樣性進行研究，為分析雪豹的消化生理和能量攝取機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為雪豹的保護和飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

糞便樣本于2014年冬季采集自青海省西寧動物園4只半散放飼養(yǎng)的健康成年雪豹，其中雄性3只，分別命名為樣本5、6和7；雌性1只，命名為樣本8。雪豹年齡4—8歲，體重50—60 kg，食物以新鮮牛羊肉為主，偶爾添加活兔。所有實驗動物在樣本采集前的3個月內(nèi)均未使用抗生素或益生菌治療。在動物自然排便后的30 min內(nèi)，用無菌取樣袋采集新鮮糞便樣本，將每個個體的糞便標記為不同的樣本，用干冰運回實驗室，置于-80℃冷凍保存。

1.2 DNA提取與16S rRNA基因擴增

使用QIAamp?DNA Stool Mini Kit試劑盒(Qiagen，Germany)對糞便樣本(100 mg/樣本)的基因組DNA進行提取，使用通用引物27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGCAC-3′)擴增細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)。PCR反應(yīng)體系為30 μL，包括PCR反應(yīng)緩沖液15 μL，雙端引物各1.5 μL，模板DNA 10 μL，ddH2O 2 μL。PCR步驟包括：94℃預(yù)變性4 min；(94℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s)，35個循環(huán)；最后延伸72℃，10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用凝膠提取試劑盒(Axygen，China)純化PCR產(chǎn)物，使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent，USA)進行質(zhì)量控制，根據(jù)羅氏生命科學公司對DNA濃度和PCR技術(shù)的要求，以等摩爾比的方式合成擴增文庫，使用Roche A sequencing primer kit試劑盒(Roche，Swiss Confederation)借助Roche GS FLX高通量測序平臺進行焦磷酸測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參照標簽序列將下機數(shù)據(jù)分配到樣本中去。選擇堿基數(shù)在300—600 bp的序列用于后續(xù)分析。應(yīng)用Qiime軟件(Version 1.9.1)進行質(zhì)控，并刪除嵌合體序列，獲得有效序列[29-31]。應(yīng)用UPARSE 軟件(Version 7.0.1001)將有效序列進行聚類，依據(jù)97%的序列相似性劃分OTU[32]。從每個OTU里面選擇一個豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，應(yīng)用Mothur軟件包(Version 1.35.1)與 SILVA’s SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(設(shè)置threshold=0.8—1.0)比對，進行物種注釋[33]，獲取各分類階元(門、綱、目、科、屬)的物種信息，計算α多樣性指數(shù)，包括Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，Ace，Goods-coverage。依據(jù)OTU信息繪制各分類階元柱狀圖；依據(jù)α多樣性指數(shù)進行β多樣性分析，繪制花瓣圖和熱圖。

2 結(jié)果

經(jīng)過質(zhì)控和去除嵌合體序列后，共得到83 512條有效序列，序列的平均長度為351 bp?；?7%的序列相似性，從樣本5、6、7和8中分別獲得98、114、104和136個OTU?；贠TU的Goods coverage，Chao 1，Ace，Shannon-Weiner和Simpson指數(shù)見表1。

表1 雪豹腸道微生物物種豐度和α多樣性指數(shù)

Tab.1 Species abundance and α diversity of snow leopard fecal microbial communities

2.1 分類組成

在雪豹糞便樣本中共發(fā)現(xiàn)9個細菌門，18綱，31目，64科，82屬。其中豐度最高的5個細菌門分別為：厚壁菌門(Firmicutes，26.58%—46.59%)、放線菌門(Actinobacteria，29.21%—45.96%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，1.61%—16.26%)、梭桿菌門(Fusobacteria，2.03%— 24.78%)和變形菌門(Proteobacteria，3.10%—5.79%)，它們占雪豹糞便微生物OTU總數(shù)的99.7%以上(圖1)。在門的水平上，雪豹糞便微生物組成存在一定差別：樣本5的擬桿菌門豐度(16.23%)高于樣本6(8.13%)、樣本7(4.09%)和樣本8(1.61%)，但放線菌門的豐度(29.21%)低于樣本6(45.96%)、樣本7(40.38%)和樣本8(43.71%)。樣本7中厚壁菌門(26.59%)豐度低于樣本5(46.59%)、樣本6(37.50%)和樣本8(43.72%)，但是梭桿菌門(24.78%)豐度比樣本5(2.03%)、樣本6(5.24%)和樣本8(6.79%)要高。

放線菌門放線菌綱(Actinobacteria)的紅蝽菌目(Coriobacteriales)占OTU總數(shù)的40.38%—45.96%，是雪豹糞便樣本中最豐富的類群(樣本5除外)。在樣本5中，超過50%的序列被歸類到梭菌綱(Clostridia)(55.42%)并且主要為梭菌目(Clostridiales)。除此之外，還有其他4個綱的豐度較高，分別是梭桿菌綱(Fusobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、變形菌綱(Betaproteobacteria)和丹毒絲菌綱(Erysipelotric)，這6個綱的比例占OTU總數(shù)的90%以上(91.54%—98.57%)(圖2)。

大多數(shù)序列可以在科水平上分類(圖3)。然而，還存在部分未分類序列，它們分別占樣本5、6、7、8的OTU總數(shù)的0.79%、0.95%、0.20%和2.22%。紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)是雪豹糞便樣本中豐度最高的科，除樣本5(占比29.2%)之外，在其他3個樣本中均占OTU總數(shù)的40%以上。其他豐度較高的科包括毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、梭菌科(Clostridaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、消化鏈球菌科(PeptoStreptococcusaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)。這些科所包含的OTU在每個樣本中均占OTU總數(shù)的90%以上。

在屬的水平上，柯林斯氏菌屬(Collinsella)是雪豹糞便樣本中豐度最高的屬，其次是狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)、梭菌屬(ClostridiumXI)、擬桿菌屬(Bacteroides)、球菌-直腸真桿菌屬(Blautia)和丹毒絲菌屬(Erysipelotrichaceaeincertaesedis)等。在樣本5中只有2條序列被歸類為梭桿菌屬(Fusobacterium)，并且沒有序列被歸類到巨單胞菌屬(Megamonas)，而在其他樣本中至少1%的序列被歸類到這些屬。在樣本5、6、7中，約1%—5%的序列被分類為薩特氏菌屬(Sutterella)，而在樣本8中沒有序列被歸類到該屬。在屬的水平上，未分類的序列所占的百分比為14.88%(樣本7)—24.31%(樣本5)(圖4)。

圖1 雪豹腸道微生物門水平相對豐度Fig.1 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the phylum level

圖2 雪豹腸道微生物綱水平相對豐度Fig.2 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the class level

圖3 雪豹腸道微生物科水平相對豐度Fig.3 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the family level

圖4 雪豹腸道微生物屬水平相對豐度Fig.4 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the genus level

2.2 多樣性分析

為比較樣本間微生物群落的差異，基于各樣本的OTU豐度和thetayc系數(shù)繪制熱圖，結(jié)果表明，樣本6和樣本7之間相似程度最高，然后是樣本5和樣本6。樣本8與其他3個樣本差異較大(圖5)。

通過基于各樣本屬的豐度繪制熱圖，分支樹的拓撲結(jié)構(gòu)顯示樣本5、6和7聚集在一起，樣本8為單獨一支(圖6)。

圖5 基于各樣本OTU豐度和thetayc系數(shù)繪制的熱圖Fig.5 Heatmap of the jaccard and thetayc coefficients 注：顏色表示4個樣本腸道微生物OTU的豐度，其中黑色(值=0.0)代表最低，紅色(值=1)代表豐度最高。用鄰接法計算系統(tǒng)發(fā)育樹，用完全聚類法確定樣品間的關(guān)系 Note：The outlying mark number was the fourth sample.The color code represents the similarly of the four sample gut microbe communities，where black(value=0.0)represents the lowest and red(value=1)the highest level of abundance.Dendrogram showed the bacterial distribution among the four samples.The bacterial phylogenetic tree was calculated using the neighbor-joining method，and the relationship among samples was determined by thetayc distance and the complete clustering method

圖6 不同樣本屬水平豐度熱圖Fig.6 The heatmap plot depicts the abundance of each colon library at genus level 注：屬的相對豐度通過顏色強度來展示，采用完整聚類方法和thetayc系數(shù)確定樣品間的關(guān)系 Note：(variables clustering on the Y-axis)within each sample(X-axis clustering).The relative values for bacterial genus are depicted by color intensity with the legend indicated at the top of the figure.Clusters using the neighbor-joining method based on the distance of the four samples along the X-axis and the bacterial genera along the Y-axis are indicated in the upper part and left of the figure，respectively.The relationship among samples was determined by thetayc coefficients and the complete clustering method

基于樣本的OTU豐度構(gòu)建了維恩圖以比較不同樣本的相似性(圖7)。在319個OTU中，所有樣本共有OTU為19，分別包括樣本5、6、7和8的文庫的19.39%、16.67%、18.27%和13.97%。樣本5和6、樣本5和7、樣本5和8、樣本6和7、樣本6和8以及樣本7和8之間的OTU共享數(shù)分別為28、31、30、37、43和42。

圖7 基于樣本OTU豐度構(gòu)建的韋恩圖Fig.7 Venn diagram at distance 0.03 constructed to compare the similarity of different samples based on OTUs

3 討論

腸道微生物在食肉動物的食物消化、健康和免疫中發(fā)揮著重要作用。研究者基于傳統(tǒng)的一代測序技術(shù)通過16S rRNA基因測序報道了雪豹糞便微生物群落中包括4個細菌門：放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[6]。在本研究中，我們使用高通量454焦磷酸測序技術(shù)研究了圈養(yǎng)雪豹的主要腸道微生物群，檢測到9個細菌門，其中5個核心菌門分別是：放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和變形菌門。

據(jù)報道，厚壁菌門和擬桿菌門在成年人的腸道和糞便微生物群中占主導(dǎo)地位，它們占OTU總數(shù)的90%以上[34-35]。在人類和其他哺乳動物的消化道微生物群落中，放線菌門通常只占很小的一部分[35-38]。然而，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在雪豹糞便樣本中放線菌門的豐度與厚壁菌門相似。在樣本6和樣本7中，放線菌門的豐度(40.38%—45.96%)甚至超過厚壁菌門(26.58%—37.50%)。這一結(jié)果與Zhang對雪豹腸道微生物的研究結(jié)果一致[22]。只有少數(shù)研究報道了放線菌門是哺乳動物腸道微生物的主要菌門。一項使用454焦磷酸測序?qū)θ祟惸c道微生物群落進行研究的文章表明，放線菌門是人類和貓腸道中豐度前二位的門[39-40]。另一項研究討論了成年貓營養(yǎng)物質(zhì)攝取與糞便微生物群之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)補充低聚果糖可以使貓糞便中放線菌門中的雙歧桿菌增加[41]。另有報道推斷，由于放線菌門的細菌G+C含量較高，使用通用細菌引物和PCR方案的應(yīng)用可能導(dǎo)致放線菌門的檢測出現(xiàn)偏差[42]。分類群特異性PCR方法顯示，包括家貓在內(nèi)的成年哺乳動物中放線菌門的含量相對豐富[43]。此外，有研究認為，基于CPN60的方法能夠較好地檢測放線菌門的細菌[40，44]。

擬桿菌門是家貓等哺乳動物遠端腸道和糞便微生物群中的另一個重要的門[38，45-46]。研究表明，擬桿菌門的豐度在種間和種內(nèi)水平上存在很大差異[15，39，47]。另一項關(guān)于家貓消化道的報告中，屬于擬桿菌門的細菌僅占約10%[13]。本文我們通過高通量測序，在雪豹的糞便樣本中檢測到的較低豐度的擬桿菌門，這與基于一代測序?qū)ρ┍c道微生物的研究結(jié)果一致[22-23]。

總之，本數(shù)據(jù)首次采用高通量焦磷酸測序技術(shù)研究雪豹糞便微生物，發(fā)現(xiàn)了雪豹糞便微生物的獨特特征，特別是高豐度的放線菌門。這一結(jié)果將有助于進一步開展雪豹的消化生理學研究，從而為雪豹的救護飼養(yǎng)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。從雪豹糞便樣本中共檢測到的319個OTU中，Venn圖顯示只有大約19個OTU是4個樣本共有的，表明雪豹腸道微生物存在較大的個體差異。盡管我們盡力通過改進方法來減少實驗誤差，但由于16S rRNA基因序列的數(shù)據(jù)庫是有限的，所以仍有一定比例的OTU無法進行有效分類。與此同時，本研究中使用的樣本來自圈養(yǎng)雪豹，其食物和棲息地環(huán)境與野生雪豹不同。因此，在下一步研究中，需要進一步補充野生樣本，增加樣本量并嘗試更多的高通量測序方法，以更深入地了解雪豹的腸道微生物群落特點，為雪豹營養(yǎng)生態(tài)學研究和保護服務(wù)。