袁耀華 劉群秀 裴恩樂

(上海動物園，上海，200335)

野生動物腸道微生物區(qū)系，作為一個生態(tài)系統(tǒng)，在維持動物個體的健康中發(fā)揮著十分重要的作用[1]，它密切影響著宿主的消化[2]、代謝[3]、營養(yǎng)[4]、免疫[5]和發(fā)育[6-7]等，因此腸道微生物群落又被稱為“被遺忘的器官”[8]。腸道微生物區(qū)系的建立過程非常復雜，微生物通過幼齡動物與母體及生境的接觸進入其腸道，并經(jīng)過與宿主的相互適應、選擇和協(xié)同進化[9]，逐漸形成穩(wěn)定的腸道微生物區(qū)系[10-11]。正常情況下，腸道菌群對宿主具有生物屏障、抑制致病菌和腐敗菌、提供營養(yǎng)、提高免疫力等促進健康作用，宿主則為腸道菌群提供生存環(huán)境[12]。因此，腸道菌群是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，宿主、食物、腸道菌群之間通過互作保持動態(tài)的平衡與穩(wěn)定，一旦這種平衡與穩(wěn)定被打破，機體的健康狀況會受到嚴重的威脅[13]。近年來，有關哺乳動物腸道微生物的研究涉及東北虎(Pantheratigrisaltaica)[14]、狼(Canislupus)[15]、大猩猩(Gorilla)[16]和大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)[17]等，發(fā)現(xiàn)大部分哺乳動物腸道微生物的菌種在生物學分類上基本屬于5—8個門。研究表明，哺乳動物腸道微生物與宿主間存在著協(xié)同進化，其構成與宿主的進化歷程、食性組成及消化等均有密切關系[18]。腸道菌群的傳統(tǒng)研究方法為細菌培養(yǎng)法，該法準確率低，會使微生物資源大量丟失[19]；隨著以16S rDNA為基礎的分子生物技術如RAPD 、AFLP、DGGE、TGGE[20]等的發(fā)展，微生物檢測工作得到了全面提高，但這些方法耗時長，工作量大，只能檢測出一定豐度以上的菌群或某種特定微生物。近幾年來，隨著核酸測序技術的發(fā)展和測序成本的降低，高通量測序技術已在多個領域得到廣泛應用，目前已成為微生物群落檢測的最先進手段[21]，包括Illumina Solexa/GA平臺，羅氏454測序平臺、ABI SOLiD平臺[22]和Miseq測序平臺[23]，均得到廣泛應用。

馬來熊(Helarctosmalayanus)隸屬于食肉目(Carnivora)、熊科(Ursidae)、馬來熊屬，是國家Ⅰ級重點保護野生動物，CITES將其列入附錄I(www.cites.org)，IUCN將其評估為易危(VU)(IUCN 2017)。近年來，馬來熊野外種群呈下降趨勢(www.iucnredlist.org)，生境喪失導致其種群數(shù)量比100年前減少25%[24]。馬逸清等對中國野生馬來熊數(shù)量進行估計，認為其數(shù)量約為140只左右[25]，侯萬儒和胡錦矗估計中國馬來熊數(shù)量在145只左右[26]。有關馬來熊的研究比較匱乏，主要集中在野外生態(tài)[27-31]、繁殖生理[32-35]、行為[36-40]、飼養(yǎng)[41-42]、疾病[43-47]和分子生物學[48-51]等方面，有關腸道微生物的研究尚未見報道。本研究首次引入Illumina Miseq高通量測序技術，對上海動物園圈養(yǎng)馬來熊的糞便微生物開展研究，旨在通過糞便微生物探索馬來熊腸道菌群的多樣性及其優(yōu)勢組成，本研究將為今后馬來熊腸道菌群的研究提供新的更準確、科學的數(shù)據(jù)資源，同時也為馬來熊腸道菌群的分子生物學研究提供技術參考，同為深入研究馬來熊胃腸道微生態(tài)、消化生理、生態(tài)防治和科學的飼養(yǎng)管理提供依據(jù)，為防治馬來熊因腸道菌群失調而引起的疾病及胃腸道菌群的調控奠定理論基礎。

1 研究方法

1.1 研究地點和研究對象

選取上海動物園的3只成年馬來熊為研究對象，為確保研究對象的代表性和研究結果的準確性，所選馬來熊個體均無腹瀉病，出生至現(xiàn)在無明顯疾病，且未使用過抗生素。3只馬來熊的個體信息見表1。

實驗期間所喂日糧包括：蘋果、梨、香蕉、番茄、胡蘿卜、黃瓜、熟土豆、雞蛋、牛奶和窩頭，窩頭主要成分為：玉米、小麥、麩皮、豆粕、大麥、磷酸氫鈣、石粉、無核棗、鹽。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品收集

2013年12月，采集馬來熊的新鮮糞便，為避免采樣差異，所有樣本采集工作由1人完成。收集糞便時佩戴一次性無菌手套，用消毒藥匙選取糞便團中央的部分，放入無菌采樣袋中，密封，-80℃冷凍保存，盡快提取糞便中的總DNA，以防細菌繁殖。每只馬來熊取4次糞便，共取12個樣本，分別將同一只馬來熊4次所取的糞便樣本混合成1份，共獲得3份混合糞便樣本。

表1 試驗馬來熊的個體信息

Tab.1 Basic information for the sun bears

1.2.2 DNA的提取

糞便總DNA的提取使用德國Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp DNA stool mini kit試劑盒完成，稱取200 mg糞便樣品于2 mL的離心管中，具體步驟按照QIAamp DNA stool mini kit試劑盒說明書進行操作，為了提高糞便中革蘭氏陽性菌的破壁效率，在加入ASL后在95 ℃水浴鍋中溫育5 min，其余步驟同試劑盒說明書。最終提取的DNA溶于50 μL AE中。提取的總DNA經(jīng)紫外分光光度計測定純度，總DNA樣品濃度不低于5 ng/μL，總量不低于10 μg，OD260/280值為1.8—2.0，OD260/230值大于1.5，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 16S rDNA V4區(qū)PCR擴增

以下過程在北京金唯智生物科技有限公司進行。細菌16S rDNA片段長度適中，有多個區(qū)段高度保守，信息量較大易于分析。根據(jù)16S rDNA的保守區(qū)域，可以設計出通用引物，用來擴增出群體中所有細菌的16S rRNA片段，通用引物序列如下：

上游引物，5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

下游引物：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

擴增采用25 μL反應體系。16S rDNA基因的V4區(qū)進行PCR擴增后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收純化；構建DNA-seq測序文庫，使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序，測序長度2×250 bp，每個樣品提供約0.3 M Reads。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

對樣品進行Illumina Miseq雙末端(Pair-end)測序之后，需要對微生物群落16S rRNA測序結果的生物信息進行分析。先對測序結果進行圖像識別(Base calling)，按照barcode標簽完全匹配方式提取測序序列。使用NGS QC Toolkit v2.3軟件對原始數(shù)據(jù)進行優(yōu)化處理，去除引物和接頭序列，質量控制，截斷或者舍棄低質量序列，得到有效序列。用Mother(v.1.34.0)對Reads進行拼接，去除拼接結果中含有N的序列，篩選片段長度并去除嵌合體序列。篩選出的V4片段使用UCLUST方法進行OTU聚類分析，使用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析?；贠TU聚類分析結果，對各個樣本進行多種多樣性指數(shù)分析，包括物種累積曲線、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)，并對測序深度進行檢測；應用UniFrac軟件PCoA分析中的兩種度量方法，unweighted unifrac和weighted unifrac對樣本進行聚類分析，比較不同樣本間的進化距離。

2 結果

2.1 馬來熊糞便菌群結構分析

共分析來自3只馬來熊個體的糞便樣本DNA，進行Illumina Miseq雙末端測序(pair-end sequencing)。每個糞便樣本菌群在物種分類水平上(門、綱、目、科、屬)的分布情況有差異(表2)，在物種多樣性水平上：LS02>LS01>LS03。

表2 馬來熊糞便菌群的分類組成

Tab.2 Classification of the fecal microbes of sun bears

在“門”的水平上，3個糞便樣本中包含一個古菌門(Crenarchaeota)、少量尚未確定系統(tǒng)地位的細菌(Unclassifid)和15個細菌菌門(表3)。

15個菌門按照所占比例的大小排序，分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、未定門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、衣原體門(Chlamydiae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。其中有7個菌門是3只馬來熊糞便樣本中共有的：厚壁菌門(54.70%)、變形菌門(41.90%)、梭桿菌門(1.80%)、藍藻菌門(0.70%)、放線菌門(0.20%)、擬桿菌門(含量少)、未定門TM7(含量少)。每個菌門在3只馬來熊糞便中的含量有差異。其余8個菌門僅分布于部分樣本，且所含的序列數(shù)很少。上海動物園圈養(yǎng)馬來熊冬季腸道菌群以厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門為主要優(yōu)勢菌門(表3)。

表3 馬來熊糞便微生物在門水平上的分類組成

Tab.3 Classification of fecal microbe in feces of sun bears at phylum level

注：Total為3個樣品的菌群豐度平均值；0.00表示該菌門所占的比例很低，但不是0

Notes：Total indicates mean value of microbes fecundity.0.00 indicates low percentage but not zero

(1)厚壁菌門

3個糞便樣本中檢測出的該菌門最多，占總序列的54.70%。該菌門中的優(yōu)勢菌群按序列多少排列為芽孢桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱(Clostridia)和丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)。其中芽孢桿菌綱包含乳桿菌目(Lactobacillales)和芽孢桿菌目(Bacillales)，乳桿菌目為優(yōu)勢菌群，該目中鏈球菌科(Streptococcaceae)和腸球菌科(Enterococcaceae)的菌群為優(yōu)勢菌群，鏈球菌科中的鏈球菌屬(Streptococcus)為優(yōu)勢菌群，腸球菌科中絕大多數(shù)為腸球菌屬(Enterococcus)。梭菌綱中的梭菌目為優(yōu)勢菌群，該目中主要以消化鏈球菌科為主，該科中的梭菌屬(Clostridium)含量最多。

(2)變形菌門

檢測出該菌門占總檢出序列的41.90%。主要以變形菌綱(Gammaproteobacteria)為主，該綱中多歸屬于巴斯德菌目(Pasteurellales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)，巴斯德菌目中僅有1個巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，該科中大部分菌群未鑒定到屬。腸桿菌目中以大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia_Shigella)為優(yōu)勢菌群。

(3)梭桿菌門

梭桿菌門僅包含1個梭桿菌目(Fusobacteriales)，該目中包含梭桿菌科(Fusobacteriaceae)和纖毛菌科(Leptotricheae)兩科，其中，梭桿菌科為優(yōu)勢菌群，該科中的醋酸桿菌屬(Cetobacterium)及梭桿菌屬(Fusobacterium)為優(yōu)勢菌群。

(4)其余菌門

藍藻菌門僅包含一個藍藻綱(Cyanophyceae)。放線菌門主要以棒狀桿菌屬(Corynebacterium)為主；擬桿菌門主要以鞘壁醇桿菌屬(Sphingobacterium)為主。

測定的3個糞便樣品中，能夠確定到屬的序列占69.0%。3個樣品一共含有不重復的細菌265屬，其中只有127屬是3個樣品共有的，每個樣品都存在特有屬。在屬多樣性水平上：LS02>LS01>LS03(圖1)。含量大于1%的菌屬有7種，其中鏈球菌屬最多(23.2%)，其次是大腸桿菌/志賀菌屬(14.8%)和梭狀桿菌屬(12.1%)。含量大于1%且小于10%的菌屬包括：圖利茨菌屬(Turicibacter)(6.4%)、梭菌屬(9.1%)、 腸球菌屬(1.6%)和醋酸桿菌屬(1.8%)。

2.2 馬來熊糞便菌群多樣性比較

基于每個糞便樣本的OTU數(shù)量和指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)observed_species(圖2a)、 Chao1(圖2b)曲線圖比較一致均顯示LS02在樣本量達到一定數(shù)量后會越過LS03和LS01，達到最高，與OUT分析結果及物種種類統(tǒng)計結果一致，LS02樣本物種豐富度最高，其次為LS01、LS03，但shannon曲線顯示與該結果不一致(圖2c)。

2.3 菌群聚類分析

unweighted unifrac和weighted unifrac聚類分析結果均顯示，LS01和LS02的腸道菌群進化距離最近，LS03和LS02的進化距離最遠(表4)。

圖1 馬來熊糞便微生物在屬水平上的分布韋恩圖Fig.1 Wayne distribution of microbes in the feces of sun bears at genus level

表4 馬來熊糞便微生物的聚類分析的距離矩陣(weighted 和unweighted)

Tab.3 Distance matrix for cluster analysis of fecal microbes of sun bear(weighted and unweighted)

注：*weighted.**unweighted

圖2 3只馬來熊糞便樣本中菌群豐度曲線Fig.2 Microbe fecundity in the feces of 3 sun bears 注：a.Observed species曲線；b.Chao1曲線；c.Shannon曲線 Note：a.Observed species curve.b.Chao1 curve.c.Shannon curve

3 討論

細菌16S rRNA片段長度適中，有多個區(qū)段高度保守信息量較大易于分析。根據(jù)保守區(qū)域，可以設計出通用引物，用來擴增出群體中所有細菌的16S rRNA片段，也可以通過可變區(qū)的差異來分不同的菌種。本研究在Miseq平臺的2×250 bp測序基礎上，測定16S rDNA V4區(qū)的方法對馬來熊的腸道菌群進行檢測，借助通用引物深度測序，能有效覆蓋16S rRNA的單一可變區(qū)(V4，一般為300—400 bp左右)，發(fā)現(xiàn)低豐度細菌和未知細菌，進而可全面、準確地獲得糞便中菌群的信息。

在“門”的水平上，在馬來熊糞便中發(fā)現(xiàn)15門菌群，一個古菌門及少量尚未定分類地位的細菌(Unclassified)，盡管這些尚未定分類地位的細菌含量較少，不足0.05%，但這些新發(fā)現(xiàn)可以對馬來熊腸道菌群的后續(xù)研究做出重要的補充。通過比較，馬來熊糞便菌群結構與其他很多哺乳動物物種基本一致，糞便樣本菌群均以厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門為優(yōu)勢菌門[3，52]。大熊貓與馬來熊同屬食肉目(Carnivora)，但主食竹子，在其糞便中發(fā)現(xiàn)菌群歸屬于6個門，其中沒有未定門及放線菌門，取而代之的是酸桿菌門(Acidobacteria)[17]，其前4個優(yōu)勢菌門和馬來熊一致。黑熊(Ursusthibetanus)的腸道菌群中共鑒定歸類有12個“門”的微生物，包括厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門等。人的腸道可以劃分出20個“門”的菌群，具有更高的多樣性，但需要說明的是，人的腸道菌群仍然是以厚壁菌門和變形菌門為主[53-54]。狼和虎都屬于食肉目的純肉食性動物，研究表明，狼的腸道菌群歸屬于5個門，沒有藍藻菌門和未定門[15]，虎的腸道菌群歸屬于6個門，其中沒有藍藻菌門[55]。同雜食性動物相比，純食肉的狼和虎腸道中的菌群門類較少，腸道菌群多樣性較低。馬來熊糞便菌群中以“屬”為分類等級的菌群為鏈球菌屬含量最多，其次是大腸桿菌/志賀菌屬和梭狀桿菌屬，大熊貓糞便中的優(yōu)勢菌屬依次為梭狀桿菌屬、大腸桿菌/志賀菌屬和和圖利茨菌屬[21]；北極熊(Ursusmaritimus)、灰熊(Ursushorribilis)、黑熊的腸道菌群中的優(yōu)勢菌群為腸桿菌屬、腸球菌屬和腸桿菌科、腸球菌屬和梭菌屬[56]，物種的不同可能是造成以上同科動物腸道菌群差異的主要原因。此外，野生動物腸道中的菌群還會受到飲食[57]、個體[18]、年齡[1，58]、環(huán)境[59]、季節(jié)[60]等多方面的影響。

哺乳動物腸道菌群與動物的營養(yǎng)和消化有密切關系，表現(xiàn)在合成宿主所需的維生素、參與糖、淀粉和脂肪的代謝等[61]。大熊貓可以編碼肉食動物消化系統(tǒng)所需要的酶，但缺少消化纖維素的酶的編碼基因，而其體內存在與纖維素、半纖維素、木質素消化相關的菌群，包括：梭菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)等[17]。馬來熊為雜食性動物，其腸道內發(fā)現(xiàn)與纖維消化相關的菌群：梭菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬、假單胞菌屬、圖利茨菌屬 、鞘氨醇單胞菌屬和擬桿菌屬；研究表明，熊類的腸道中有纖維消化相關的菌群，但這些菌是長期定植在腸道中的或是過路菌，尚不明確，需要進一步研究。本研究中，圈養(yǎng)馬來熊的日糧及飼養(yǎng)環(huán)境等會直接影響其腸道菌群結構，但這些因素到底如何影響動物糞便菌群的結構組成仍然是未解之謎，部分原因是這些因素常常互相關聯(lián)，所以無法確定到底是那個因素導致了腸道微生物結構的變化[62]?；诖?，田銀平對腸道菌群與動物食性之間的相互作用提出相反的觀點，即動物食性的變化也可能是由其腸道菌群的變化而引起的[55]。多樣化的菌群首先在動物腸道內定植，為動物食性的轉變提前做好準備，進而保證動物發(fā)生食性轉變時能夠在生理上適應，并存活和遺傳下來。

哺乳動物自出生時起，胃腸道開始有外來微生物棲息并定植，腸道菌群逐漸形成，并隨著宿主生長發(fā)育而不斷發(fā)生動態(tài)變化[63]。研究表明，宿主的性別和年齡是決定腸道菌群組成的重要因素之一[1，64-66]。對不同年齡段川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)的腸道菌群的研究結果表明，川金絲猴腸道菌群的多樣性與優(yōu)勢菌群數(shù)量伴隨年齡增長不斷變化，其腸道菌群多樣性呈增加到減少的一個趨勢，而優(yōu)勢菌群的數(shù)量變化不一致，有的呈增加的趨勢，有的呈減少的趨勢[67]。本研究中，3只馬來熊的糞便樣本中的優(yōu)勢菌門一致，但同一菌門在不同個體糞樣中的含量不同；在綱、目、科、屬水平上的菌群數(shù)量、種類及豐度也存在差異，3個糞便樣品都存在特有屬，每只馬來熊糞便菌群的多樣性也不同，說明馬來熊糞便菌群存在個體差異，且具有個體特異性。哺乳動物腸道菌群組成隨著宿主的不同而發(fā)生變化[68]，由于取樣的3只馬來熊在日糧和飼養(yǎng)環(huán)境上相同，我們認為年齡很可能是導致本實驗結果的主要因素，此外動物個體的生理狀態(tài)等也有可能對糞便菌群造成影響，當動物生理狀態(tài)和所處環(huán)境發(fā)生變化，腸道菌群也會產(chǎn)生動態(tài)變化，但菌群依然會向平衡方向發(fā)展[68]。

致謝：本研究完成過程中，得到東北林業(yè)大學野生動物自然保護地學院田秀華教授的大力支持，在此表示衷心感謝。