胡桓嘉 滕 萍 李 媛 番玉買 李宏剛 王勒端 段玉寶*

(1.德宏州野生動(dòng)物收容救護(hù)中心，德宏，678400；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校極小種群野生動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650224；3.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明，650224)

分子生物學(xué)技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)生分析，動(dòng)植物及微生物的遺傳多樣性研究也有涉及，常用作分子標(biāo)記的基因有細(xì)胞色素C氧化酶I亞基(COI)、細(xì)胞色素b(Cytb)、16S rRNA基因等[1-3]。通過測(cè)定DNA序列對(duì)物種進(jìn)行鑒定具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，16S rRNA較為保守，進(jìn)化速率相對(duì)較低，可利用通用引物擴(kuò)增，適合進(jìn)行物種鑒定[4]。16S rRNA基因已廣泛應(yīng)用在哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、魚類以及無脊椎動(dòng)物的種屬鑒定、親緣關(guān)系、遺傳多樣性等研究中[2，5-7]。

白眉長(zhǎng)臂猿屬(Hoolock)隸屬于靈長(zhǎng)目(Primates)長(zhǎng)臂猿科(Hylobatidae)，現(xiàn)存3個(gè)物種分別為西白眉長(zhǎng)臂猿(Hoolockhoolock)、東白眉長(zhǎng)臂猿(H.leuconedys)和高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿(H.tianxing)[8-10]。其中高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿是2017年由我國(guó)學(xué)者命名的新種，從東白眉長(zhǎng)臂猿中分離出來，兩者成年個(gè)體在眉毛、胡子及眶下毛發(fā)存在差異[8]。之前我國(guó)分布的東白眉長(zhǎng)臂猿，和高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿實(shí)為同物異名，是國(guó)家 Ⅰ 級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為易危物種(VU)。長(zhǎng)臂猿屬物種幼年個(gè)體其鑒別并不明顯，鑒別時(shí)存在困難。因此，本研究基于16S rRNA對(duì)白眉長(zhǎng)臂猿屬3個(gè)未知物種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，檢驗(yàn)該基因在靈長(zhǎng)類物種鑒定上的可行性，并為靈長(zhǎng)類物種的司法鑒定提供理論依據(jù)。

1 研究材料

研究材料采自云南省德宏州野生動(dòng)物收容救護(hù)中心救護(hù)的3個(gè)白眉長(zhǎng)臂猿屬物種幼體，均由當(dāng)?shù)厣止擦P沒救助(表1，圖1)。通過口腔拭子采集3個(gè)物種的唾液，分布標(biāo)記為B1、B2、B3，裝進(jìn)保存管后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱冷凍保存。

表1 3個(gè)物種的基本信息

Tab.1 Information on three species of Hoolock genus

圖1 3個(gè)待鑒定的白眉長(zhǎng)臂猿屬物種(從左及右分別是B1，B2，B3)Fig.1 Three species of Hoolock genus(From left to right are B1，B2 and B3)

2 研究方法

2.1 DNA提取

DNA提取通過使用自上海生工生物工程技術(shù)有限公司購買的Ezup 柱式唾液、尿液基因組DNA 抽提試劑盒完成。取適量唾液樣品，裝入1.5 mL離心管中，DNA提取方法參閱試劑盒所帶說明書，收集的DNA溶液置于-20℃冰箱保存。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物參考Kocher(1989)和Suwannapoom(2017)的引物16Sar(5′-CGCCTGTTTAYCAAAAACAT-3′)and 16Sbr(5′-CCGGTYTGAACTCAGATCAYGT-3′)[11-12]。采用普通PCR對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：TaqPCR Master Mix 7.5 μL，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，模板1 μL(20—50 ng/μL)，加37.5 μL ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3—5 min，94℃變性30 s，55—60℃復(fù)性25—30 s，72℃延伸30—50 s，72℃再延伸5—8 min，35個(gè)循環(huán)。引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

2.3 序列處理

首先使用Seqman檢驗(yàn)所得目的序列，切掉兩端信號(hào)較差的峰圖；然后在NCBI上進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，對(duì)所得序列進(jìn)行初步鑒定。參考下載白眉長(zhǎng)臂猿屬物種序列(表2)，使用MEGA7.0對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)，剪切整齊之后保存為FASTA文件[13]。利用ClustalX 1.83將FASTA文件另存為NEXUS文件，DAMBE 5.2.31對(duì)所有序列進(jìn)行飽和度檢驗(yàn)[14-15]。

設(shè)置西白眉長(zhǎng)臂猿為外群，PAUP 4.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹估算[16]。利用MrBayes v3.1.2構(gòu)建貝葉斯樹，jModeltest估算核苷酸替代模型，設(shè)置貝葉斯核苷酸替換類型nst為6，位點(diǎn)間變異速率分布rates為invgamma，運(yùn)行馬爾科夫鏈150 000，每100代取樣1次，運(yùn)算完成后標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0.01[17-18]。最后將PAUP 4.0估算的系統(tǒng)發(fā)育樹與貝葉斯樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)合并分析，用PPT(Microsoft PowerPoint 2010)進(jìn)行美化。

表2 白眉長(zhǎng)臂猿屬線粒體基因組的GenBank檢索號(hào)和序列來源

Tab.2 The accession number and the resources of sequences of Hoolock

3 結(jié)果

3.1 序列比對(duì)及檢驗(yàn)結(jié)果

在NCBI中的BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，B1與東白眉長(zhǎng)臂猿(GenBank序列號(hào)：KY250071.1)的同源性為100%，B2與高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿(GenBank序列號(hào)：KY250070.1)的同源性為100%，B3與東白眉長(zhǎng)臂猿(GenBank序列號(hào)：KY250074.1)的同源性為99.61%，初步認(rèn)為B1、B3為東白眉長(zhǎng)臂猿，B2為天行長(zhǎng)臂猿。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)序列的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Iss=0.006 6

圖2 基于16S rRNA基因構(gòu)建白眉長(zhǎng)臂猿屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees construction of Hoolock based on 16S rRNA gene

4 討論

目前，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的種群現(xiàn)狀受到嚴(yán)重威脅，能夠準(zhǔn)確鑒定物種種類對(duì)于其救助、放歸具有重要意義。東白眉長(zhǎng)臂猿和高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿在外部形態(tài)上較為相似，成年雄性在兩眉毛間距離、眉毛濃重程度、胡子及生殖腺上毛的顏色來區(qū)別；而成年雌性眼周(特別是眼睛兩側(cè)、眼下)白色毛發(fā)的多少或有無，作為鑒別特征[8，19]。但是幼體或者亞成體，形態(tài)特征特別是毛的顏色并不穩(wěn)定，無法準(zhǔn)確識(shí)別到物種級(jí)別。例如：高黎貢白眉長(zhǎng)臂猿亞成體的眼下無白色毛發(fā)，而部分東白眉長(zhǎng)臂猿幼體的眼下，也無白色毛發(fā)，故通過形態(tài)辨別白眉長(zhǎng)臂猿的幼體或亞成體并不科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。

線粒體DNA的16S rRNA基因進(jìn)化速度較低，是線粒體基因中適合種及以上水平的分子系統(tǒng)學(xué)研究，在哺乳動(dòng)物(如蜂猴屬Nycticebus、鵝喉羚Gazellasubgutturosa)物證鑒定中成功應(yīng)用[2，20]。雖然16S rRNA 基因存在一定的缺陷，存在比COI通用序列更為有效的DNA 條形碼區(qū)域[21]。例如，王冬亮等運(yùn)用16S rRNA 基因鑒定了牛肉干樣品中肉品來源，其中65%的產(chǎn)品非來自食肉牛肉，損害了消費(fèi)者的利益[22]。本次系統(tǒng)發(fā)育的聚類結(jié)果與BLAST結(jié)果一致，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示兩種白眉長(zhǎng)臂猿形成兩個(gè)姐妹支，支持率也達(dá)到100%，進(jìn)一步證實(shí)了16S rRNA在非人靈長(zhǎng)類物種鑒定上的可行性。