肖望成 楊 勇 魯紅林 李 娟 于 鑒 李 朝段 綱 曾 成* 曾邦權(quán) 段博芳 代飛燕*

(1.云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.昆明市瀕危動植物收容拯救中心，昆明，651700；3.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201)

池鷺(Ardeolabacchus)又稱紅毛鷺、中國池鷺等，屬鷺科(Ardeidae)池鷺屬，典型的涉禽類。通常無聲，有時會發(fā)出低沉的呱呱叫聲。世界上的鷺科鳥類共有17屬60種118個亞種，其中池鷺屬有6個種2個亞種；我國鷺科鳥類共有9屬20種18個亞種，但是池鷺屬只有1個，無亞種[1-2]。池鷺分布范圍廣泛，主要分布在孟加拉國、中國、東南亞等地區(qū)，在中國主要分布在長江流域以及河北、青海、陜西南部、吉林省等地區(qū)[3]。池鷺屬我國國家Ⅱ級保護(hù)動物，生活在我國長江以南流域，喜在山腳灌木竹群間靠近河流水源地群居，集群于水域周圍高大的喬木營巢[4]。作為南方分布較廣的濕地鳥，主要以魚類為食，蛙類和昆蟲為輔[5]。云南省昆明市滇池是主要的越冬水禽主要聚集地，據(jù)涂文姬等在2015—2016年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，滇池越冬的鳥類從種屬上來看有22%鷺科，其中池鷺為留鳥(替代型遷徙候鳥)中的稀有種[6-7]。池鷺不僅具有較高的觀賞價值，同時對林業(yè)有一定影響，其繁殖地的變更可作為良好環(huán)境變化的指標(biāo)[8-9]。目前國內(nèi)關(guān)于鷺鳥的研究主要集中在其繁殖生態(tài)，食物多樣性，地方物種多樣性，血液指標(biāo)分析。

福氏志賀桿菌(ShigellaflexneriCastellani)系腸桿菌科(Enterobacteriaceae)志賀桿菌屬中的乙群革蘭陰性兼性厭氧菌。該菌能夠通過侵襲并穿透腸黏膜上皮細(xì)胞，引起人和其他動物典型的菌痢癥狀，具有高度傳染性和危害性，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱﹑腹痛腹瀉﹑腸痙攣﹑血便等，治療不及時會出現(xiàn)肺炎、敗血癥等并發(fā)癥。引起人類感染僅需少量志賀菌(10—100個)[10]。在全世界范圍內(nèi)，每年大約有2億人口感染，100多萬人死亡，其中50%—70%是由福志賀桿菌引起的。先后有志賀菌感染食蟹猴(Macacafascicularis)、牛(Bovine)、家兔(Lepus)等的報道，但關(guān)于野生動物的報道很少[11-13]。許蘭菊等[14]首次報道志賀氏菌在我國雞上的感染主要表現(xiàn)為腹瀉癥狀，剖檢病變?yōu)閲?yán)重的腸道出血；王潤錦等[15]在腹瀉的藏雞病料中分離到兩株福氏志賀桿菌。另外志賀桿菌也極易產(chǎn)生耐藥性，并呈現(xiàn)多藥耐藥的特點[16]

蛔蟲(Ascaris)主要寄生在宿主的胃腸道內(nèi)，能引起宿主生長發(fā)育緩慢、消瘦、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時可能造成腸梗阻導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害著人和動物的健康[17-18]。黃威[19]在長江中下游越冬白頭鶴(Grusmonacha)腸道寄生蟲多樣性研究發(fā)現(xiàn)，在感染的樣本中，含有1種和2種寄生蟲的樣本檢出率最高，感染率最高的為艾美爾球蟲，其次為禽蛔蟲；黃超等[20]在動物園綠孔雀(Pavomuticus)腸道寄生蟲流行特征調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，球蟲的感染率達(dá)64.58%，蛔蟲感染率為22.50%，且隨季節(jié)呈現(xiàn)動態(tài)變化，散養(yǎng)的感染強(qiáng)度多于圈養(yǎng) 1 個“+”?；紫x是一種土源性寄生蟲，隨糞便和土壤傳播，生活史簡單，在一定的溫度、濕度和空氣等條件下蛔蟲卵容易發(fā)育為感染性蟲卵，且蟲卵具有較強(qiáng)的抵抗力，能在土壤里存活很久，因此會導(dǎo)致宿主反復(fù)感染，且感染率較高[21-22]。池鷺又通常喜歡棲息于水域附近，且食性主要以動物性食物為主，因此，池鷺在飲食和飲水的時候易吞食感染性蟲卵，從而感染蛔蟲病。故試驗探究一例池鷺?biāo)劳霾±?，為我們做好野生動物的預(yù)防保護(hù)工作提供依據(jù)，也為池鷺的研究提供科學(xué)素材。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年5月云南昆明市西山區(qū)死亡池鷺，無菌采集腸內(nèi)容物和寄生蟲。普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院的公共平臺實驗室配制提供，并經(jīng)檢驗合格。藥敏紙片、生化鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)及細(xì)菌形態(tài)觀察

取腸內(nèi)容物，用劃線接種法接種于普通肉湯里，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12—24 h，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果再挑取單個典型菌落劃線接種于普通瓊脂平板37 ℃進(jìn)行純化培養(yǎng)[18]。

經(jīng)分離得到的純培養(yǎng)物用劃線接種法分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和10%綿羊血脫纖維瓊脂培養(yǎng)基(由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院配制并檢驗合格)上置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16—24 h，觀察菌落形態(tài)及在各種培養(yǎng)基上的生長情況。將純培養(yǎng)后的菌落，進(jìn)行革蘭氏及瑞氏染色。

1.3 生化試驗

參照文獻(xiàn)[18]，將純培養(yǎng)后的菌落接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等20種生化管。37 ℃培養(yǎng)24—48 h，觀察其生化特性。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

分離純化細(xì)菌后，抽提基因組DNA利用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增16S rDNA基因片段[19]。以新鮮培養(yǎng)的菌液為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，對菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，預(yù)混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)通用型DNA純化回收試劑盒說明書回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果提交到NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對，找到同源性最高的幾個序列，確定分離細(xì)菌屬，尋找同源性最高的細(xì)菌，下載該屬的序列，用DNAstar構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參考菌株信息見表1。

表1 參考菌株信息

Tab.1 Reference strain information

1.5 寄生蟲檢測

取大約2 g左右的糞便置于一個小燒杯中，先在燒杯中加入少量飽和食鹽水，用玻璃棒將糞便攪拌調(diào)勻，然后向燒杯中加入約為糞便10倍量左右的飽和食鹽水，并用玻璃棒攪拌均勻，用40目的銅絲篩將糞樣過濾到青霉素小瓶內(nèi)，在瓶口輕輕蓋一個載玻片，不能產(chǎn)生氣泡，每組做3份平行，濾液靜置約15—20 min左右，此時比飽和食鹽水比重輕的蟲卵大多浮于液體表面，然后將載玻片提起進(jìn)行鏡檢。

取5條形態(tài)相同蟲體，命名為XC1，將蟲體放置在1.5 mL的離心管內(nèi)剪碎，分別加入200 μL緩沖液GA與20 μL蛋白酶K，然后將樣品置于56 ℃的水浴鍋里消化過夜。按DNA提取試劑盒里的使用說明書提取蟲體基因組總DNA，然后將其保存在-20℃下。

參照Gasser等[23]設(shè)計的引物擴(kuò)增此線蟲的COX1基因，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段的大小約450 bp，上游引物JB3(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)，下游引物JB4.5(5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)。引物合成于上海生物工程股份有限公司。從這5份池鷺消化道線蟲樣品提出的總DNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增出每份樣品的pCOX1片段，反應(yīng)擴(kuò)增體系在25 μL下進(jìn)行，預(yù)混DNA聚合酶12.5 μL，模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。同時設(shè)陽性和陰性對照。取7 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳儀上檢測，檢測結(jié)果通過紫外透射儀拍照記錄[21]。每份樣品經(jīng)PCR鑒定后為陽性的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向測序，然后將測序結(jié)果用SeqMan 5.01軟件進(jìn)行拼接。序列拼接成功后將其上傳至NCBI-GenBank，用Blast與GenBank中已公布的線蟲pCOX1基因序列進(jìn)行在線比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 分離培養(yǎng)

純化后分離出1菌株在血平板上生長良好，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后，在血平板上出現(xiàn)邊整齊、表面光滑、灰白色菌落。在普通營養(yǎng)瓊脂上形成圓形突起、光滑、濕潤、半透明，灰白色、邊緣整齊的，中等偏大的菌落，直徑為2—3 mm；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成無色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成無色菌落，在顯微鏡下可以觀察到大量的革蘭氏陰性桿菌，初步懷疑為志賀氏菌。

2.2 生化試驗

分離菌的生化結(jié)果如表2。據(jù)生化結(jié)果可初步判XJ為志賀氏菌屬。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA 測序，將獲得的16S rDNA 基因序列與 GenBank中登錄細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行比對，表明該分離菌16S rDNA 基因序列與已發(fā)表的志賀氏菌的16S rDNA基因同源性較高，達(dá)98%以上，由圖1可知，目的基因片段大小為1 500 bp，與理論值一致，且與鏡檢和生化試驗鑒定結(jié)果一致，證明該菌屬為志賀氏菌。將該分離株與參考菌株16S rDNA 序列進(jìn)行比對分析，顯示該株福氏志賀桿菌與江蘇分離株EU409294.1屬于同一分支，與墨西哥分離株LC318444.1親緣關(guān)系較近(圖2)。

表2 分離菌株生化鑒定結(jié)果

Tab.2 Biochemical identification results of isolated strains

注：+為陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)

Note：+ Means positive，-Means negative

圖2 16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 16S rRNA phylogenetic tree

2.4 寄生蟲檢測結(jié)果

將PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，我們可以從電泳圖見約443 bp的條帶(圖3)，與我們所預(yù)期的目的片段的大小差異并不大，且沒有特異性條帶出現(xiàn)。將池鷺消化道線蟲COX1的有效序列用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast比對分析，該序列與GenBank上已公布的弓首屬(Toxocara)的牛弓首蛔蟲(Toxocaravitulorum)的相似率為90%，該比對結(jié)果表明所檢獲的池鷺消化道線蟲屬于蛔目(Ascaridida)弓首科(Toxocaridae)蛔蟲。

圖3 池鷺線蟲COX1 mtDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplication of nematode mtDNA COX1 from Ardeola bacchus 注：M：DL2000DNA Marke；1、3：陰性對照；2：陽性對照；4：XC Note：M：DL2000DNA Marke.1 and 3：Negative control.2：Positive control.4：XC

3 討論

志賀氏菌常引發(fā)細(xì)菌性痢疾，通稱為痢疾桿菌，并且其在自然界中分布較為廣泛，經(jīng)常會導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾，具有高度傳染性，人類對志賀氏菌易感[10]，這對人類和動物健康都造成嚴(yán)重的影響[12]。分析云南省昭通市細(xì)菌性痢疾流行特征發(fā)現(xiàn)，1964—2005年昭通市細(xì)菌性痢疾病例中福氏志賀菌檢出率平均占 88.66%，除1985年占57.57%，其他年度均在83%以上，可見本地區(qū)主要流行菌群以福氏志賀菌為主[24]。一般來說，福氏志賀氏菌所致菌痢的病情較重，排菌時間長，易轉(zhuǎn)為慢性。這樣患病動物攜帶致病菌，更容易通過糞便污染水源，進(jìn)而威脅到人類健康。志賀氏菌能夠在潮濕土壤中生存34 d，37 ℃水中生存20 d，在糞便內(nèi)(室內(nèi)溫度)生存11 d。滇池水域是昆明最大的流動水域，也是池鷺活動最頻繁的區(qū)域，在此水域中，福氏志賀氏菌對昆明市民的健康有潛在的威脅[25]。人在接觸可能攜帶福氏志賀菌的糞便或食用含有的食品和飲水后，細(xì)菌在胃部酸性環(huán)境中生長，穿過小腸后到達(dá)結(jié)腸，侵入結(jié)腸黏膜引起急性壞死性結(jié)腸直腸炎，會表現(xiàn)為突然的水樣、黃色、粉紅色膠胨狀的腹瀉，伴有高熱、廢食、精神不振，排黏液血便，有的出現(xiàn)全身毒學(xué)癥癥狀，嚴(yán)重者可有感染性休克和(或)中毒性腦病，病情遷延不愈成為慢性或可反復(fù)發(fā)作。關(guān)于志賀氏菌專門侵襲直腸和結(jié)腸黏膜的機(jī)理還不清楚，有學(xué)者認(rèn)為是由于直腸和結(jié)腸黏膜在志賀氏菌存在的情況下對急性水腫異常敏感導(dǎo)致的，Sansonetti等則推測志賀氏菌表飼導(dǎo)致的，志賀氏菌標(biāo)記到達(dá)一個結(jié)腸特定的黏附系統(tǒng)[26]。所有已報道該病病例僅局限在腸黏膜。但筆者認(rèn)為，志賀氏菌病從宿主自身來看，可以認(rèn)為是由于宿主在侵襲性微生物存在時對水腫調(diào)節(jié)作用失衡的一種痢疾表現(xiàn)。

蛔蟲是寄生于多種脊椎動物小腸內(nèi)的大型線蟲，不需要中間宿主而隨土壤傳播，其蟲卵在土壤中能夠長期存活，當(dāng)動物不小心攝食被感染性蟲卵污染的飲水和食物時就會感染蛔蟲，引起蛔蟲病。李薇等[27]在云南省德宏州隴川縣拉影鎮(zhèn)與芒市遮放鎮(zhèn)兒童腸道寄生蟲感染調(diào)查和楊毅梅[28]等關(guān)于云南省農(nóng)村人群腸道蠕蟲感染現(xiàn)狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)蛔蟲感染率分別為12.06%﹑19.88%，占據(jù)比較大的比例。在野生動物寄生蟲感染的文獻(xiàn)查閱中發(fā)現(xiàn)，蛔蟲感染強(qiáng)度通常居于第二[19-20]。蛔蟲主要寄生在動物的小腸內(nèi)，大量或慢性的感染蛔蟲會引起宿主營養(yǎng)不良、腹痛、腹瀉和消瘦等不良癥狀，嚴(yán)重時會造成腸梗阻導(dǎo)致死亡。家養(yǎng)畜禽和野生動物感染蛔蟲率較高，引起蛔蟲病的發(fā)生，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中，野生動物腸道內(nèi)最常見的寄生蟲主要有犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)[21]、獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)[29]、馬副蛔蟲(Parascarisequorum)和豬蛔蟲(Ascarissuillae)等蛔蟲。

池鷺是一種遷徙鳥，途經(jīng)地區(qū)較多且活動范圍較廣泛，因此極易感染蛔蟲病。另外，池鷺是一種觀賞性動物，在動物園里活動時游客有時會對它投喂食物，從而可能使人感染蛔蟲病。池鷺屬于國家Ⅱ級保護(hù)動物，此次收集到的樣品為野外的野生動物，可以為我們做好野生動物的預(yù)防保護(hù)工作提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

本例池鷺?biāo)劳鍪怯晒卓苹紫x和福氏志賀桿菌混合感染引起，該株福氏志賀桿菌與江蘇分離株EU409294.1屬于同一分支，與墨西哥分離株LC318444.1親緣關(guān)系較近。