楊淑玲， 廖先萍， 范 星， 庹 潯

(1. 南昌大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 江西 南昌 330000； 2. 南昌大學(xué) 藥學(xué)院， 江西 南昌 330000)

1 引 言

黃體酮(Progesterone，PROG)是由卵巢黃體分泌的一種內(nèi)源性類固醇激素，對雌激素激發(fā)過的子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學(xué)影響，可以保護(hù)女性的子宮內(nèi)膜[1]。在女性懷孕期間，PROG可以降低子宮緊張度且抑制其興奮性，使孕激素所引起的子宮內(nèi)膜增殖期轉(zhuǎn)為分泌期，為孕卵著床提供有利條件并維持妊娠，同時(shí)促進(jìn)乳房發(fā)育，抑制排卵，支持并保障胎兒的早期生長及發(fā)育。PROG也是臨床干預(yù)先兆流產(chǎn)的常用藥物之一[2]，但是大劑量黃體酮會給孕婦帶來乳腺脹痛、腸道不適、偏頭痛等副作用[3]。

血清白蛋白是生物體內(nèi)重要的載體蛋白，能運(yùn)輸許多藥物分子到達(dá)受體部位發(fā)揮藥效，還能與內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合起到儲存的作用[4-5]。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)的序列十分相似, 兩者之間的同源性高達(dá)76.5%，且不同氨基酸均為保守性替換[4]。BSA相較于HAS價(jià)廉易得，因此研究人員將BSA作為化學(xué)生物學(xué)中研究人類血清白蛋白性質(zhì)的常用模型。利用光譜學(xué)技術(shù)特別是熒光光譜技術(shù)揭示BSA與藥物小分子之間的相互作用機(jī)制的研究工作已有廣泛報(bào)道[5-6]。隨著大量蛋白質(zhì)三維精細(xì)結(jié)構(gòu)的確定以及計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的快速發(fā)展，分子對接技術(shù)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用的有效手段[6-8]。例如，王曉霞等運(yùn)用該方法探究了鹽酸四環(huán)素與BSA的相互作用[9]。盡管國內(nèi)外的學(xué)者對黃體酮多方面的藥理作用已經(jīng)有所認(rèn)識，但其中大多是關(guān)于黃體酮在先兆流產(chǎn)及腦神經(jīng)保護(hù)等臨床應(yīng)用方面的研究[3,10]，尚未關(guān)注PROG在體內(nèi)的傳輸機(jī)制以及與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬整合光譜學(xué)和分子對接技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在分子水平探究PROG與運(yùn)輸?shù)鞍?BSA)之間的相互作用機(jī)制，為揭示PROG對人體健康的影響提供數(shù)據(jù)參考。

2 實(shí) 驗(yàn)

2．1 試劑與儀器

試劑：BSA(BIOFROXX，德國，純度≥98%)，以超純水為溶劑配制成1×10-2mol·L-1的BSA儲備液，-20 ℃冷藏備用,臨用逐級稀釋；PROG(上海源葉生物公司，純度≥99%)，用乙醇配制成1×10-2mol·L-1溶液，-20 ℃冷藏備用,臨用稀釋；Tris-HCl緩沖溶液：pH=7.4，含0.15 mol·L-1氯化鈉以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

測試儀器:日立F-4500熒光光譜儀(帶溫控設(shè)備，石英比色皿)；METTLER TOLEDO pH計(jì)；布魯克TERSON-27紅外光譜儀(帶ATR附件)。

2．2 實(shí)驗(yàn)方法

2．2．1 熒光光譜和同步熒光光譜

293 K時(shí)，準(zhǔn)確移取3 mL的Tris-HCl緩沖液至1 cm的比色皿中，固定緩沖溶液中BSA濃度為3.33×10-7mol·L-1，逐漸增加PROG濃度(每次改變3.33×10-7mol·L-1)，掃描300～450 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜并記錄結(jié)果，298，303,310 K的研究與上述步驟一致。

設(shè)置熒光的波長差值Δλ分別為15 nm和60 nm，掃描同步熒光光譜并記錄結(jié)果。

2．2．2 分子對接技術(shù)研究PROG和BSA的相互作用

PROG的結(jié)構(gòu)采用ChemBio3D Ultra14.0生成，并用MMFF94分子力場進(jìn)行最低能量優(yōu)化，將得到的構(gòu)型用于分子對接操作；從RSCB數(shù)據(jù)庫中下載BSA的晶體結(jié)構(gòu)(編號1H9Z)，用Chemra程序檢查該晶體結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基并使之完整；采用軟件AutoDock Vina和Pymol對PROG和BSA的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理并模擬兩者1 ∶1結(jié)合時(shí)的構(gòu)象[6]。使用LigPlus+分析PROG和BSA之間的疏水作用力及氫鍵。

2．2．3 紅外光譜測定

按照文獻(xiàn)[11]的實(shí)驗(yàn)方法測定BSA游離體系和PROG-BSA復(fù)合物體系的紅外光譜。儀器參數(shù)設(shè)置如下：分辨率4 cm-1，掃描背景和樣品次數(shù)64次。

3 結(jié)果與討論

3．1 PROG與BSA 相互作用的熒光光譜分析

BSA結(jié)構(gòu)中的芳香族氨基酸殘基(Trp/Tyr/Phe)能夠發(fā)射一定強(qiáng)度的內(nèi)源熒光[8,12]。當(dāng)以280 nm為激發(fā)波長時(shí)，345 nm譜帶為這些氨基酸的主要熒光信號，而在該條件下PROG不發(fā)熒光。因此利用熒光光譜探究PROG對BSA熒光強(qiáng)度的影響可以很好地揭示兩者之間的相互作用機(jī)制。如圖1所示，隨著研究體系中PROG濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明PROG誘導(dǎo)BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，即兩者之間存在相互作用。

[BSA]1-9= 3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-9=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33, 16.66, 20, 23.33, 26.66)×10-7mol·L-1

圖1 PROG-BSA體系的熒光光譜

Fig.1 Fluorescence spectra of PROG-BSA system

3．2 PROG與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)與作用力類型判斷

根據(jù)Stern-Volmer方程處理熒光光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以進(jìn)一步推斷猝滅機(jī)理：

F0/F=1 +Ksv[Q]=1 +Kqτ0[Q],

(1)

在298 K時(shí)，PROG 對BSA的猝滅速率常數(shù)Kq為5.0×1012L·mol-1·s-1，比各種猝滅劑對生物大分子的最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1高出2個(gè)數(shù)量級，由此可以判斷PROG的存在誘導(dǎo)BSA的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅[4,13]。

根據(jù)方程(2)可以計(jì)算PROG-BSA體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q],

(2)

由擬合直線的斜率和截距所得結(jié)果如表1所示。隨著體系溫度的上升，PROG與BSA之間的結(jié)合常數(shù)Ka逐漸降低，進(jìn)一步確認(rèn)PROG對BSA具有靜態(tài)猝滅作用[12,14]。此外，在人體體溫范圍(36～37 ℃)內(nèi)PROG與BSA的結(jié)合常數(shù)達(dá)到104級別，說明其進(jìn)入人體后與血液中的白蛋白具有較強(qiáng)的相互作用[14]，從而被白蛋白運(yùn)輸?shù)桨衅鞴?。通過分析藥物與蛋白質(zhì)大分子反應(yīng)前后兩者熱力學(xué)熵變ΔS和焓變ΔH的相對大小即可判斷復(fù)合物的作用力類型[14-16]。若ΔH<0、ΔS<0，主要表現(xiàn)為范德華力和氫鍵；ΔH<0、ΔS﹥0，主要表現(xiàn)為靜電作用力；ΔH﹥0、ΔS﹥0，主要表現(xiàn)為疏水作用力。根據(jù)表1可知，ΔG<0，ΔH<0、ΔS<0，說明反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行，且PROG和BSA之間的作用力為范德華力和氫鍵。

表1 不同溫度下PROG-BSA體系的熱力學(xué)常數(shù)

3．3 PROG與BSA的結(jié)合位點(diǎn)的確定

從表1可知，PROG和BSA之間存在1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。BSA有兩個(gè)與小分子藥物結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于結(jié)構(gòu)域ⅡA(結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ)和ⅢA(結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ)內(nèi)[14,17]。位點(diǎn)Ⅰ中含有兩個(gè)能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸(Trp和Tyr)，而位點(diǎn)Ⅱ只含有Tyr殘基。激發(fā)波長為280 nm時(shí)，可同時(shí)激發(fā)Trp和Tyr熒光，而激發(fā)波長為295 nm僅能激發(fā)Tyr的熒光[18]。因此，對比不同激發(fā)波長時(shí)PROG對BSA的熒光猝滅程度，可確定復(fù)合物體系的結(jié)合位點(diǎn)。如圖2所示，熒光光譜結(jié)果表明，激發(fā)波長為280 nm時(shí)，PROG對BSA的熒光猝滅程度明顯大于295 nm時(shí)PROG對BSA的熒光猝滅程度，即Trp殘基和Tyr殘基均參與了猝滅過程，說明PROG和BSA的結(jié)合位點(diǎn)為位點(diǎn)Ⅰ[19]。

圖2 不同濃度PROG下BSA的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of BSA at different concentrations of PROG

[BSA]=3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-5=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33)×10-7mol·L-1

圖3 PROG-BSA體系的同步熒光光譜。(a)λ=15 nm; (b)λ=60 nm。

Fig.3 Synchronized fluorescence spectra of PROG-BSA system. (a)λ=15 nm. (b)λ=60 nm.

3．4 PROG對BSA構(gòu)象的影響

[BSA]=[PROG]=3.33×10-7 mol·L-1

Fig.4 FT-IR spectroscopy of BSA and PROG-BSA system

表2 加入PROG前后BSA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的百分含量

Tab.2 Percentage of each conformation in BSA before and after addition of PROG

體系α-螺旋/%β-折疊/%β-轉(zhuǎn)角/%β-片層/%BSAPROG-BSA64.0760.6811.6626.0019.4011.994.871.33

當(dāng)PROG與BSA的物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，α-螺旋含量由64.07%降低到60.68%，即PRORG的存在會誘導(dǎo)BSA α-螺旋構(gòu)象減少。紅外光譜和同步熒光的結(jié)果相互印證，都表明PROG會使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。

3．5 PROG和BSA結(jié)合能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移定理，當(dāng)小分子藥物與蛋白質(zhì)之間滿足最大距離在7 nm范圍內(nèi)，將會發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移[13,21]。如圖5所示，PROG和BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移的可能性。將光譜重疊部分采用矩形分割法求出PROG和BSA濃度比為1 ∶1時(shí)，兩者積分值J=6.87×10-17cm·L·mol-1、R0=1.07 nm、r0=1.63 nm。PROG和BSA反應(yīng)的結(jié)合距離小于7 nm，滿足非輻射能量轉(zhuǎn)移條件，即PROG和BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致BSA熒光猝滅。

[BSA]=[PROG] =3.33×10-6 mol·L-1

Fig.5 Overlapping of fluorescence spectrum of BSA(a) and ultraviolet absorption of PROG(b)

3．6 分子對接

分子模擬可以在理論上對生物大分子和活性小分子之間作用的模式進(jìn)行合理預(yù)測[13,16-17]。本研究使用AutoDock Vina對PROG和BSA的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合情況進(jìn)行模擬分析。模擬結(jié)果表明PROG進(jìn)入BSA結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的吉布斯自由能ΔGⅠ=-36.425 kJ，進(jìn)入位點(diǎn)Ⅱ的吉布斯自由能ΔGⅡ=-34.332 kJ。根據(jù)相關(guān)熱力學(xué)理論，可以推測當(dāng)PROG和BSA結(jié)合時(shí)，PROG更傾向于進(jìn)入BSA的結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ內(nèi)結(jié)合，模擬結(jié)果與位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6顯示了PROG進(jìn)入到BSA中的疏水空腔I時(shí)兩者形成復(fù)合物的三維構(gòu)象。通過LigPlus+軟件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PROG與Trp214、Lys199、Lys195、Ala291等氨基酸殘基之間存在相互作用。除此之外，PROG還與Lys195殘基之間存在鍵長為0.288 nm的氫鍵。Trp214是BSA的主要發(fā)光基團(tuán)，由此可知PROG與Trp214的相互作用是引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因，該結(jié)果與熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 PROG與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的分子對接模擬圖。(a)AutoDock Vina軟件分析結(jié)果；(b)Ligplus+軟件分析結(jié)果。

Fig.6 Molecular docking model of PROG and BSA. (a)Analysis results by AutoDock Vina. (b) Analysis results by Ligplus+.

4 結(jié) 論

通過整合多種光譜學(xué)和分子模擬技術(shù)方法對PROG與BSA的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果表明，PROG能夠自發(fā)與BSA形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物。熒光光譜和分子對接結(jié)果互相印證，都表明PROG與Trp214之間的相互作用是導(dǎo)致BSA熒光猝滅的主要原因。紅外光譜結(jié)果顯示PROG誘導(dǎo)BSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在正常人體體溫條件下，PROG與BSA的結(jié)合常數(shù)達(dá)到104級別，說明兩者之間具有較強(qiáng)的相互作用。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究黃體酮在生物體內(nèi)的作用機(jī)制提供了一定的參考數(shù)據(jù)。