喻珮 劉璐 李志娟 付淵博 袁芳 李彬

[摘要] 參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)》將膝骨關(guān)節(jié)炎模型分為小型動(dòng)物模型、大中型動(dòng)物模型及靈長類動(dòng)物模型，并將國內(nèi)外常用動(dòng)物模型依據(jù)自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型進(jìn)行歸類。自發(fā)性模型包括天然自發(fā)模型、轉(zhuǎn)基因模型，誘發(fā)性模型分為飲食誘發(fā)、藥物注射誘發(fā)、手術(shù)誘發(fā)、制動(dòng)誘發(fā)及寒冷誘發(fā)。不同模型的選擇以及造模方法的應(yīng)用，各自適用于不同的研究目的。

[關(guān)鍵詞] 膝骨關(guān)節(jié)炎;動(dòng)物模型;造模方法;研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（c）-0041-04

Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis

YU Pei1，2? ?LIU Lu1? ?LI Zhijuan1，2? ?FU Yuanbo1? ?YUAN Fang1? ?LI Bin1

1.Department of Acupuncture and Moxibustion， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University? Beijing Key Laboratory of Acupuncture Neuromodulation， Beijing? ?100010， China; 2.Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] According to National Standard for Laboratory Animals， knee osteoarthritis models are divided into small animal models， large and medium animal models and primate animal models. The commonly used animal models at home and abroad are classified according to spontaneous model and induced model. Spontaneous model includes natural spontaneous model and genetically modified model， while inductive model includes diet induction model， drug injection induction model， operation induction model， braking induction model and cold induction model. The selection of different models and the application of modeling methods are suitable for different research purposes.

[Key words] Knee osteoarthritis; Animal models; Induced model methods; Research progress

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是老年多發(fā)、以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯募膊?，?5～75歲人群中發(fā)病率達(dá)50%[1]，是伴隨人口老齡化逐漸成為影響人類健康的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)展必不可少的工具，KOA模型主要分為兩類：①自發(fā)性模型，指無人為干預(yù)自然產(chǎn)生;②誘發(fā)性模型，指通過人為干預(yù)誘導(dǎo)產(chǎn)生。由于KOA機(jī)制復(fù)雜，理想動(dòng)物模型的構(gòu)建對(duì)于研究其發(fā)病機(jī)制及療效評(píng)價(jià)尤為重要。

1 模型分類

1.1 小型動(dòng)物模型

據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)》，KOA小型動(dòng)物模型主要由鼠類構(gòu)成，早期表現(xiàn)出類似人KOA特征，包括蛋白聚糖丟失、軟骨纖維化、骨贅形成等[2]。同時(shí)生命周期短，便于觀察KOA進(jìn)程，為研究其病變機(jī)制提供了新思路。然而鼠類關(guān)節(jié)腔較小，造模操作存在難度，指標(biāo)測量有限制。

1.2 大中型動(dòng)物模型

大中型動(dòng)物模型主要包括兔、狗、豬、羊、馬，此類模型具有更大關(guān)節(jié)腔，便于診斷與造模。其中豬的解剖結(jié)構(gòu)、軟骨膠原纖維都與人契合度較高[3]，同時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被允許應(yīng)用于豬的轉(zhuǎn)化研究[4]。狗被部分學(xué)者認(rèn)為解剖結(jié)構(gòu)最接近研究標(biāo)準(zhǔn)，也更順從于術(shù)后管理[5-6]。此類模型不足之處在于飼養(yǎng)負(fù)擔(dān)重、疾病進(jìn)展緩慢、觀察周期長、術(shù)后管理困難。

1.3 靈長類動(dòng)物模型

靈長類模型由于生命周期長，且基因組與人相似度高，更適用于實(shí)驗(yàn)研究?，F(xiàn)今靈長類模型主要選擇獼猴類，但獼猴以四肢著地行走為主，與人類發(fā)病年齡段不同;且靈長類飼養(yǎng)價(jià)格昂貴，條件苛刻，繁殖速度慢，后期進(jìn)行標(biāo)本采集時(shí)倫理考慮也更困難。

2 模型建立

2.1自發(fā)性模型

2.1.1 天然自發(fā)模型

部分動(dòng)物可因自身關(guān)節(jié)軟骨退變形成KOA。Liu等[7]在調(diào)查獼猴自發(fā)KOA中觀察到年老組較年少組膝關(guān)節(jié)周長增加，軟骨厚度降低，軟骨細(xì)胞減少。Staines等[8]發(fā)現(xiàn)，鼠可自發(fā)形成KOA，與內(nèi)在結(jié)構(gòu)、基因控制及母胎影響皆有聯(lián)系。但自發(fā)過程耗時(shí)較長，難以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)觀察，研究者們?yōu)榇俗龀龈纳疲邔庩柕萚9]在黑鼠自發(fā)KOA基礎(chǔ)上強(qiáng)迫跑步30 min/d，KOA自發(fā)率顯著提高。

2.1.2 轉(zhuǎn)基因模型

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展，KOA動(dòng)物模型也可通過轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)。Rodriguez等[10]發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Col11a1基因，可導(dǎo)致Ⅺ型膠原不能合成正常膠原纖維，誘導(dǎo)KOA。此外還有Col9a1、Col2a1基因，銅轉(zhuǎn)運(yùn)基因，MMP-13基因，組織特異性BMP-1a型受體，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纖維調(diào)節(jié)素和基膜聚糖基因雙鏈，纖維調(diào)節(jié)素和二聚糖基因單鏈或雙鏈皆可誘發(fā)KOA[11]。

然而自發(fā)性KOA是由多基因調(diào)控產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因模型可能簡化疾病過程，因此治療措施不能相對(duì)應(yīng)用于人KOA治療中[12]。另外，轉(zhuǎn)基因模型雖對(duì)研究KOA發(fā)病的特殊基因或蛋白質(zhì)十分重要，卻是由基因異常產(chǎn)生，與勞累、環(huán)境等常見因素不符，造模成本也較高，因此能否作為KOA研究或療效評(píng)定的普通模型尚存在爭議。

2.2 誘發(fā)性模型

2.2.1 飲食誘發(fā)

臨床病因?qū)W顯示高脂飲食是一個(gè)對(duì)于負(fù)重或非負(fù)重誘發(fā)KOA的均相關(guān)因素。Lu等[13]發(fā)現(xiàn)伴隨人膳食結(jié)構(gòu)中總脂肪及飽和脂肪酸攝入的增加，關(guān)節(jié)間隙逐漸變窄。Brunner等[14]發(fā)現(xiàn)，通過增加兔膳食脂肪的攝入，可在不增加體重基礎(chǔ)上造成軟骨黏多糖含量降低，同時(shí)抑制蛋白聚糖酶表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)鼠模型中，高脂飲食可提高瘦素、脂聯(lián)素水平，同時(shí)促進(jìn)IL-1α分泌，誘導(dǎo)KOA[15]。

2.2.2 藥物注射誘發(fā)

2.2.2.1 碘乙酸鹽（MIA）? MIA可抑制Krebs循環(huán)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡[16]。Jacobs等[17]將MIA注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔，4周后觀察到大鼠步態(tài)畸形，組織病理示關(guān)節(jié)軟骨缺損、細(xì)胞排列紊亂，骨贅形成。Nagy等[18]向大鼠關(guān)節(jié)腔注射MIA，3周后造模組組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于對(duì)照組，且關(guān)節(jié)軟骨表面分層、缺失，纖維組織排布散亂。

2.2.2.2 木瓜蛋白酶? 木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，可分解軟骨中的蛋白多糖。Sukur等[19]向大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶+乙酸鈉進(jìn)行造模，28 d后蘇木精-伊紅（HE）染色顯示軟骨表面不規(guī)則、裂縫形成，軟骨細(xì)胞分布不均等KOA改變。Lin等[20]向大鼠關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸磷酸鹽混合液，12周后通過放射電子顯微鏡觀察到軟骨表面破壞，軟骨細(xì)胞核固縮、壞死等現(xiàn)象。

2.2.2.3 膠原蛋白酶? 膠原蛋白酶能破壞軟骨內(nèi)Ⅰ型膠原，使肌腱和韌帶中膠原基質(zhì)減少，造成關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)失衡。Nirmal等[21]向大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射膠原蛋白酶Ⅱ，3周后關(guān)節(jié)軟骨部分缺失，關(guān)節(jié)間隙變窄，組織病理顯示軟骨表面不規(guī)則，骨贅形成及單核細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。Jeong等[22]向?qū)嶒?yàn)鼠關(guān)節(jié)腔注射膠原蛋白酶進(jìn)行造模，12 d后發(fā)現(xiàn)滑膜液IL-6、TNF-α、IL-1β分泌增多，組織病理示滑膜表面損耗，軟骨蛋白聚糖減少，纖維組織排布散亂。

2.2.2.4 尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）? uPA是一種蛋白酶，可降解軟骨基質(zhì)的蛋白多糖，造成軟骨破壞。Shuang等[23]將SD鼠隨機(jī)分至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射uPA+生理鹽水，對(duì)照組僅注射生理鹽水，于1、2、4、6、8周進(jìn)行步態(tài)分析。實(shí)驗(yàn)組行走區(qū)域和速度均降低，搖擺步態(tài)明顯;8周后實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜細(xì)胞增殖明顯，同時(shí)淋巴細(xì)胞浸潤、IL-1β、TNF-α分泌增多。

2.2.3 寒冷誘發(fā)

寒冷主要通過刺激關(guān)節(jié)液成分變化來影響滑膜通透性，改變軟骨內(nèi)環(huán)境，誘發(fā)KOA。劉安軍等[24]采用寒冷刺激對(duì)小鼠進(jìn)行造模，30 d后發(fā)現(xiàn)造模組關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增高，病理結(jié)果及血清透明質(zhì)酸、TNF-α的升高也表現(xiàn)出典型KOA病變。林強(qiáng)等[25]通過石膏將大鼠四肢固定于4℃涼水中，每日4 h，6周后發(fā)現(xiàn)大鼠血清及滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2及γ干擾素含量均上升。

2.2.4 制動(dòng)誘發(fā)

膝關(guān)節(jié)長期固定，關(guān)節(jié)應(yīng)力發(fā)生改變會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮、韌帶組織紊亂、半月板血流減少等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致與臨床相似的KOA樣改變。Campbell等[26]將實(shí)驗(yàn)鼠下肢固定于屈曲位，32周后通過免疫組織染色觀察到膝關(guān)節(jié)前部軟骨變薄，COL-Ⅰ增多、COL-Ⅱ減少、血管從軟骨轉(zhuǎn)移到軟骨下骨生長等現(xiàn)象，提示骨替代了關(guān)節(jié)軟骨的生長。

2.2.5 手術(shù)誘發(fā)

2.2.5.1 前交叉韌帶橫斷術(shù)（ACLT）? ACLT是現(xiàn)今采用較多的構(gòu)建KOA模型方法之一，主要通過打破關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)定性來誘導(dǎo)軟骨退變。Tawonsawatruk等[27]通過ACLT對(duì)大鼠造模，分別于4、8、12周進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分，造模組明顯高于對(duì)照組;12周后HE染色顯示造模組軟骨細(xì)胞減少且分布不均。Levillain等[28]利用ACLT對(duì)兔進(jìn)行KOA造模，6周后通過共聚焦顯微鏡和組織染色觀察到關(guān)節(jié)軟骨表面磨損、骨贅形成、軟骨纖維排布混亂等改變。ACLT造模成功率高，但僅截?cái)嗲敖徊骓g帶對(duì)膝關(guān)節(jié)應(yīng)力破壞較小，常與半月板切除（MMT）搭配使用。

2.2.5.2 MMT? 半月板具有穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)、緩沖震蕩、減少摩擦等作用，半月板缺失可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性下降、磨損加重。Bagi等[29]對(duì)大鼠進(jìn)行MMT造模，10周后采取膝關(guān)節(jié)斷層掃描，顯示軟骨表面不規(guī)則、局部受損，骨贅形成。Parrish等[30]采取MMT對(duì)大鼠進(jìn)行KOA造模，術(shù)后恢復(fù)負(fù)重，3周后組織病理染色示關(guān)節(jié)軟骨鈣化，軟骨下骨硬化及骨贅形成等KOA改變。MMT主要影響關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，與軟骨破壞等無直接關(guān)系，可用于KOA應(yīng)力學(xué)研究。

2.2.5.3 Hulth法? Hulth法操作是在手術(shù)顯微鏡下打開關(guān)節(jié)腔，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前后交叉韌帶、切除內(nèi)側(cè)半月板，5周后得到KOA模型。原理為破壞膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性造成應(yīng)力不均，誘導(dǎo)軟骨退變。Rogart等[31]利用Hulth法對(duì)兔進(jìn)行造模，分別在3周與14周末對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨COL-Ⅱ進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3周末關(guān)節(jié)軟骨中COL-Ⅱ即開始降解，14周末降解更為嚴(yán)重。

2.2.5.4 膝關(guān)節(jié)刻痕法? Marijnissen等[32]首先對(duì)犬使用圓絞刀進(jìn)行軟骨劃痕，于術(shù)后強(qiáng)迫以術(shù)肢負(fù)重，每日4 h，每周3 d，20周后發(fā)現(xiàn)局部軟骨細(xì)胞出現(xiàn)變性、基質(zhì)中異染物質(zhì)消失等KOA病理改變。李釗等[33]使用小針刀對(duì)兔脛骨平臺(tái)及股骨髁軟骨進(jìn)行表面刻痕，術(shù)后強(qiáng)迫活動(dòng)30 min/d，5周后HE染色部分軟骨面糜爛，軟骨細(xì)胞減少、分布不均等變化?？毯鄯ú淮蜷_關(guān)節(jié)腔，減少了手術(shù)創(chuàng)傷，成功率高，耗時(shí)較短，在研究KOA軟骨修復(fù)上是一種理想模型。

3 小結(jié)

自發(fā)性模型不需干預(yù)，受到外界干擾較少，可盡量避免操作誤差造成的影響，更貼近人KOA進(jìn)程，但由于進(jìn)展緩慢限制了在研究中的應(yīng)用。藥物誘發(fā)模型操作簡單、耗時(shí)較短、可重復(fù)性高，在短期研究中具有一定可行性。同時(shí)具有不破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，不損傷關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，但引發(fā)的關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥大多造成軟骨細(xì)胞的死亡[34]，而人KOA主要以軟骨磨損退化、骨贅形成等變化為主，二者在病理上存在一定差異。因此，藥物誘發(fā)模型更適于研究炎癥或疼痛機(jī)制，以及療效評(píng)定的觀察。

近年手術(shù)誘導(dǎo)以病因明確、成功率高、穩(wěn)定性好成為KOA造模常用方法，主要以破壞關(guān)節(jié)軟骨、半月板或交叉韌帶來打破關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，更加符合創(chuàng)傷性KOA過程，對(duì)于研究創(chuàng)傷性KOA軟骨保護(hù)和修復(fù)是一種理想模型。同時(shí)，采取多種手術(shù)方法聯(lián)合造模效果優(yōu)于單一手術(shù)造模，且耗時(shí)較少[35]。Zhou等[36]比較采用前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶橫斷+MMT，ACLT+股骨髁劃痕法，單獨(dú)ACLT對(duì)獼猴進(jìn)行造模。8周后觀察到滑膜液WBC、IL-1β、TGF-β1分泌量，關(guān)節(jié)軟骨COL-Ⅱ、ACAN和MMP-13含量以及形態(tài)學(xué)評(píng)分均為前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶橫斷+MMT組>ACLT+股骨髁劃痕組=老年獼猴自發(fā)KOA組>單獨(dú)ACLT組>假手術(shù)組>空白組，表明多種方法聯(lián)合造模效果優(yōu)于單一方法。由此可見，在現(xiàn)代研究中應(yīng)不拘一格，采用更有效的多種方法聯(lián)合造模，為實(shí)驗(yàn)研究創(chuàng)造更多便捷。

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