李彥澤 王磊 陳志遠(yuǎn) 劉修恒

[摘要] 目的 檢測膀胱癌組織腫瘤細(xì)胞（TC）及腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞（IC）中細(xì)胞程序性死亡分子配體1（PD-L1）的表達(dá)，并探討其臨床意義。 方法 收集2018年1～12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院行手術(shù)治療的87例膀胱癌患者手術(shù)切除組織石蠟標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)SP263染色方法，檢測標(biāo)本TC和IC中PD-L1的表達(dá)情況。 結(jié)果 PD-L1在膀胱癌組織IC中陽性表達(dá)率高于TC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），二者呈正相關(guān)關(guān)系（P < 0.01）。PD-L1在膀胱癌組織TC中，陽性表達(dá)與年齡、性別和病理分級(jí)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;在IC中，陽性表達(dá)與年齡、病理分級(jí)和肌層浸潤有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 膀胱癌組織TC和IC中PD-L1表達(dá)水平的異常上調(diào)可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 膀胱癌;程序性細(xì)胞死亡分子配體1;腫瘤細(xì)胞;腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R737.14? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（c）-0077-04

Expression of PD-L1 in tumor cells and tumor-associated immune cells of bladder cancer and its clinical significance

LI Yanze? ?WANG Lei? ?CHEN Zhiyuan? ?LIU Xiuheng

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To detect expressions of programmed cell death ligand 1 （PD-L1） in tumor cells （TC） and tumor-infiltrating immune cells （IC） of bladder cancer and investigate its clinical significance. Methods The paraffin-embedded specimens of 87 patients with bladder cancer undergoing surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from January 2018 to December were collected. The expressions of PD-L1 in TC and IC were detected by immunohistochemical SP263 staining. Results The positive rate of PD-L1 expression in bladder cancer IC was higher than that in TC， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）， while there was a positive correlation between them （P < 0.01）. The positive expressions of PD-L1 in TC of bladder cancer were related to age， gender and pathological grade， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. While the positive expressions in IC were associated with age， pathological grade， myometrial invasion， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The abnormal up-regulation of PD-L1 expression in TC and IC of bladder cancer tissues may be closely related to the occurrence and development of bladder cancer.

[Key words] Bladder cancer; Programmed cell death ligand 1; Tumor cell; Tumor-infiltrating immune cell

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，2017年美國有超過7.9萬例新發(fā)病例，在我國膀胱癌的發(fā)病率達(dá)到80.5/10萬[1]。其中尿路上皮癌是膀胱癌中最常見的組織類型，占90%以上。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)治療及膀胱灌注化療為主。對(duì)于晚期膀胱癌，包括局部進(jìn)展期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移期的膀胱癌患者，目前的治療方案是以順鉑為基礎(chǔ)的系統(tǒng)化療。然而效果不盡如人意，5年生存率不足15%。同時(shí)，強(qiáng)烈的不良反應(yīng)也使很多患者難以忍受而終止治療[2-3]。因此，近30年來，對(duì)于晚期膀胱癌的治療沒有明顯的突破和進(jìn)展[4]。然而，隨著以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為主的免疫治療的出現(xiàn)，膀胱癌的治療似乎看到了新的“曙光”[5]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠阻斷T淋巴細(xì)胞表面的負(fù)性免疫檢查點(diǎn)，激活抗腫瘤免疫，減少腫瘤的免疫逃逸。其中研究處于前列的是細(xì)胞程序性死亡分子1（PD-1）/細(xì)胞程序性死亡分子配體1（PD-L1）抑制劑，原理是通過阻斷PD-1/PD-L1的結(jié)合，抑制結(jié)合后產(chǎn)生的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而起到抗腫瘤作用[6]。目前已有多種相關(guān)藥物經(jīng)美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于晚期膀胱癌的治療。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，部分膀胱癌患者的腫瘤組織中可出現(xiàn)高表達(dá)的PD-L1，這可能是膀胱癌腫瘤逃逸的重要機(jī)制之一[7]。腫瘤組織中，PD-L1在膀胱癌組織腫瘤細(xì)胞（TC）和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞（IC）中表達(dá)水平的差異可能會(huì)潛在地影響腫瘤組織分類為PD-L1高表達(dá)或PD-L1低表達(dá)，對(duì)于免疫治療的選擇有一定的臨床意義[8]。本研究通過檢測膀胱癌組織中PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中的表達(dá)水平，分析其與膀胱癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，從而初步探究PD-L1的表達(dá)情況與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1～12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）泌尿外科因膀胱癌行手術(shù)治療患者的癌組織石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后明確病理學(xué)診斷膀胱癌;②病歷資料記載完全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①免疫系統(tǒng)疾病;②術(shù)前進(jìn)行化療、放療或其他治療;③泌尿系統(tǒng)病史。根據(jù)我院電子病歷系統(tǒng)，收集符合條件的標(biāo)本共87例。其中，低級(jí)別膀胱癌33例，高級(jí)別膀胱癌54例;非肌層浸潤性膀胱癌21例，肌層浸潤性膀胱癌66例。

1.2 方法

使用免疫組織化學(xué)SP263（Ventana）法檢測PD-L1蛋白的表達(dá)[9]。PD-L1 SP263（Ventana）是一種半定量的免疫組化方法，該方法使用兔源性的PD-L1單克隆抗體（克隆號(hào)：SP263）及OptiView DAB顯色系統(tǒng)，在羅氏Ventana BenchMark Ultra自動(dòng)化染色儀上進(jìn)行PD-L1免疫組化染色，檢測10%中性甲醛固定石蠟包埋的腫瘤組織中PD-L1蛋白表達(dá)。試驗(yàn)中使用陽性細(xì)胞（細(xì)胞系NCI-H1975）和陰性細(xì)胞（細(xì)胞系MCF-7）作為對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果由病理醫(yī)生在光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)區(qū)分腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞，根據(jù)該檢測抗體的評(píng)分指導(dǎo)對(duì)PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃染顆粒定義為陽性表達(dá)。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例，采用半定量法判斷結(jié)果：陽性率≤5%記為陰性，>5%記為陽性[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman分類變量關(guān)聯(lián)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中的表達(dá)

PD-L1在IC中的陽性表達(dá)率[58.6%（51/87）]高于TC中的陽性表達(dá)率[31.0%（27/87）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 13.385，P < 0.01）。

2.2 PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中的表達(dá)及相關(guān)性

PD-L1在TC和IC中均為陰性表達(dá)的膀胱癌組織均未見明顯染色。相反，在TC和IC中均為陽性表達(dá)的膀胱癌組織可見大部分染色。在IC陽性表達(dá)、TC陰性表達(dá)的組織中，膀胱癌細(xì)胞未見明顯染色，周圍炎性浸潤細(xì)胞出現(xiàn)明顯染色。見圖1。本研究中無TC陽性表達(dá)、IC陰性表達(dá)病例。PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中陽性表達(dá)呈正相關(guān)（rs = 0.564， P < 0.01）。

A：PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中表達(dá)均為陰性;B：PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中表達(dá)均為陽性;C：PD-L1在膀胱癌組織IC中為陽性表達(dá)，在TC中為陰性表達(dá)。PD-L1：細(xì)胞程序性死亡分子配體1;TC：腫瘤細(xì)胞;IC：腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞

2.3 PD-L1在膀胱癌組織TC和IC中的陽性表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

PD-L1在膀胱癌組織TC中陽性表達(dá)與患者性別、年齡和病理分級(jí)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。PD-L1在膀胱癌組織IC中陽性表達(dá)與患者年齡、病理分級(jí)和肌層浸潤情況有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

目前，大量關(guān)于PD-1/PD-L1抑制劑的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[11-13]。一方面，在部分試驗(yàn)中我們可以看到，PD-1/PD-L1抑制劑的療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)鉑基化療[14];而另一方面，有文獻(xiàn)報(bào)道，PD-1/PD-L1抑制劑的療效可能與患者腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平有關(guān)，PD-L1可能會(huì)成為評(píng)估患者用藥后療效及預(yù)后的生化指標(biāo)[15-16]。

PD-L1，程序性細(xì)胞死亡分子配體1，亦稱B7-H1，是T細(xì)胞表面上抑制性跨膜受體PD-1的配體之一，分布廣泛，與PD-1有較強(qiáng)的親和力[17]。PD-1與PD-L1結(jié)合后，會(huì)對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抑制性作用。在正常人群中，此機(jī)制可以防止自身免疫的發(fā)生[18];而在腫瘤患者中，則會(huì)被腫瘤細(xì)胞“利用”，成為腫瘤免疫逃逸的重要原因之一[19]。研究顯示，部分膀胱癌患者腫瘤組織中可出現(xiàn)PD-L1表達(dá)水平的升高。同時(shí)，PD-L1的表達(dá)水平可能與膀胱癌的進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)[7，20]。PD-1/PD-L1抑制劑的原理正是基于以上研究：通過阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，抑制對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫活性[21]。有國外研究報(bào)道，在腫瘤組織切片中，PD-L1在腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平存在一定的差異，但也有潛在的一致性。同時(shí)，PD-L1在二者中的表達(dá)水平均已被作為評(píng)估腫瘤患者免疫治療適用性和療效的指標(biāo)[8]。然而國內(nèi)關(guān)于PD-L1在膀胱癌組織腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況及相關(guān)分析鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，PD-L1在膀胱癌組織IC中的陽性表達(dá)率明顯高于其在TC中的陽性表達(dá)率。同時(shí)，二者的陽性表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。從這一結(jié)果可以看出，在膀胱癌的發(fā)生過程中，TC和IC的PD-L1表達(dá)是呈協(xié)同上升趨勢的。這與既往研究結(jié)果基本一致[8]，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)PD-L1是膀胱癌免疫逃逸的“幫兇”之一。本研究的另一項(xiàng)結(jié)果顯示，PD-L1在膀胱癌組織TC中的陽性表達(dá)情況與膀胱癌患者的性別、年齡和病理分級(jí)有關(guān)，即男性患者的PD-L1陽性表達(dá)要率高于女性;年齡越大、病理分級(jí)越高，PD-L1的表達(dá)率越高。PD-L1在膀胱癌組織IC中陽性表達(dá)情況與患者年齡、病理分級(jí)和肌層浸潤情況有關(guān)，即患者年齡越大，PD-L1陽性表達(dá)率越高;高級(jí)別肌層浸潤性膀胱癌患者PD-L1陽性表達(dá)率更高。這一結(jié)果顯示了膀胱癌組織TC和IC中PD-L1的陽性表達(dá)率與膀胱癌患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中PD-L1表達(dá)陽性率可能與膀胱癌的分級(jí)分期密切相關(guān)，提示PD-L1可能在膀胱癌的發(fā)展過程中起到重要的作用。

綜上所述，在膀胱癌組織中，TC和IC中的PD-L1表達(dá)協(xié)同上升，這種異常上調(diào)可能與膀胱癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，有可能成為評(píng)估膀胱癌預(yù)后和預(yù)測膀胱癌免疫治療療效的生化標(biāo)志物。膀胱癌的免疫治療已經(jīng)開始起步，同時(shí)取得了突破性的進(jìn)展，但目前仍處于初級(jí)階段，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

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（收稿日期：2019-03-27? 本文編輯：張瑜杰）