姚佳沛 徐建春 劉 煒 樊 凡

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外二科,昆明650031)

膀胱癌為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，男性發(fā)病率高于女性，考慮男性膀胱癌發(fā)病率高除了與吸煙和職業(yè)因素有關(guān)外，性激素可能是導(dǎo)致男性膀胱癌發(fā)病率高的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中ERβ呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]，如楊典東等[3]研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中ERβ呈高表達(dá)，且與膀胱癌的浸潤(rùn)性進(jìn)展和分化關(guān)系密切。本文對(duì)膀胱癌中ERβ的表達(dá)水平和沉默ERβ對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響及機(jī)制進(jìn)行研究，從細(xì)胞水平探討ERβ在膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，為膀胱癌的診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 收集我院2017年1至12月60例行膀胱癌根治術(shù)患者的膀胱癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，60例膀胱癌患者簽署知情同意書(shū)，手術(shù)前未進(jìn)行放化療等治療。人膀胱癌細(xì)胞T24和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)Sigma公司)，DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、一抗、二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，ERβ及陰性對(duì)照siRNA(上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成)等。ERβ siRNA-1干擾序列為5′-GCAAGCATGGAGGAGTGAC-3′，ERβ siRNA-2干擾序列為5′-GGCCTGTGAAACAGTGACC-3′，ERβ siRNA-3干擾序列為5′-GAGGCATTCTCGTCAGATG-3′，對(duì)3組ERβ siRNA序列進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳RNA組(即ERβ siRNA-3組)作為本研究的ERβ siRNA序列。陰性對(duì)照干擾序列為5′-TTCTGGCAAGGTCTCA-CGT-3′。

1.2方法

1.2.1膀胱癌及癌旁組織中ERβ表達(dá)測(cè)定 將膀胱癌組織和癌旁組織經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，采用SP免疫組織化學(xué)法測(cè)定膀胱癌及癌旁組織中ERβ表達(dá)(具體步驟和操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，以鼠抗人ERβ單克隆抗體為一抗，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照用已知乳腺癌ERβ陽(yáng)性反應(yīng)片。結(jié)果判斷：ERβ陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈淡黃色或棕黃色顆粒，每張切片選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中以ERβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值，每100個(gè)細(xì)胞中ERβ陽(yáng)性細(xì)胞≥10個(gè)為陽(yáng)性，<10個(gè)為陰性。

1.2.2膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞中ERβ表達(dá)測(cè)定 提取膀胱癌細(xì)胞T24和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1蛋白，BCA法測(cè)定T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞蛋白濃度，采用Western blot法測(cè)定細(xì)胞ERβ水平。取細(xì)胞蛋白上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，并孵育一抗及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記二抗，以GAPDH為內(nèi)參，ECL顯影，置于暗室中，開(kāi)啟紅外燈，將X膠片覆蓋PVDF膜條帶上，1皿中取出X膠片放入顯影液中10 s，清水沖洗，再放入定影液中15 s，清水沖洗、晾干，掃描儀記錄保存，采用Quantity one軟件測(cè)定各蛋白條帶灰度值，ERβ相對(duì)表達(dá)量=ERβ條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.3ERβ siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建、鑒定、包裝 將互補(bǔ)的ERβ siRNA序列、退火B(yǎng)uffer混合，90℃水浴4 min，冷卻至室溫。用連接酶將pRNAT-H1.4/Retro和退火產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌JM109，篩選重組質(zhì)粒，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提并純化質(zhì)粒，測(cè)序重組質(zhì)粒(華大基因科技公司)證實(shí)ERβ siRNA已正確插入逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒(pRNAT-H1.4/Retro)。將重組質(zhì)粒、PVSV-G載體和DMEM混勻孵育5 min，加入Lipofectamine 2000孵育20 min，然后轉(zhuǎn)移至293包裝細(xì)胞中培養(yǎng)8 h，更換培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察GFP熒光表達(dá)證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒高效、成功轉(zhuǎn)染到293包裝細(xì)胞中。

1.2.4T24細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將T24細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和si-ERβ組，將各組生長(zhǎng)良好且達(dá)80%以上融合的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鋪板，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化后鋪在6孔板中，在24 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h更換無(wú)抗體培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；空白對(duì)照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，si-ERβ組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ERβ siRNA。轉(zhuǎn)染后利用倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中大部分可見(jiàn)明顯的綠色熒光，證實(shí)已成功轉(zhuǎn)染。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照siRNA和ERβ siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞GFP熒光表達(dá)效率分別為72.13%、72.46%。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞ERβ和N-cadherin、Vimen-tin、MMP9蛋白水平測(cè)定 取各組轉(zhuǎn)染24 h后T24細(xì)胞，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，采用Western blot法測(cè)定各組細(xì)胞ERβ和N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平，具體方法同1.2.2。

1.2.6轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞侵襲、遷移能力測(cè)定 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室測(cè)定各組T24細(xì)胞侵襲、遷移能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將各組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞接種到6孔板中(4×105個(gè)/孔)，用200 μl槍頭劃痕，PBS沖洗3次，用含丙酮酸鈉和胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，劃痕0 h和24 h對(duì)劃痕進(jìn)行拍照觀察。Transwell小室測(cè)定侵襲能力：將轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，終止消化后棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105ml-1。取Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜上室面，使Matrigel聚合成凝膠，取細(xì)胞懸液加入Transwell小室，下室加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)液，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棉簽擦掉未侵襲細(xì)胞，高倍顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。Transwell小室測(cè)定遷移能力：Transwell小室不用Matrigel包被，其他步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)晶紫可將細(xì)胞核染成藍(lán)色，顯微鏡下觀察到的藍(lán)色為結(jié)晶紫染色的穿膜細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1ERβ在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá) ERβ陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色或棕黃色顆粒，位于細(xì)胞核中，膀胱癌組織中ERβ陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

2.2ERβ在膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá) 膀胱癌細(xì)胞T24中ERβ相對(duì)表達(dá)量(0.43±0.08)高于正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1(0.11±0.02)(t=10.976，P<0.001)。見(jiàn)圖2、3。

2.3siRNA干擾對(duì)T24細(xì)胞中ERβ水平的影響

表1 膀胱癌和癌旁組織中ERβ陽(yáng)性率比較

Tab.1 Positive rate comparison of ERβ between bladder cancer tissues and adjacent tissues

GroupsnERβ positive rateERβ negative rateAdjacent tissues60357Bladder tissues602832χ227.184P<0.001

圖1 膀胱癌和癌旁組織中ERβ免疫組化染色(×200)Fig.1 Immunohistochemistry stain of ERβ in bladder cancer and adjacent tissues(×200)Note: A.Bladder tissue；B.Adjacent tissues.

與空白對(duì)照組(0.38±0.07)和陰性對(duì)照組(0.39±0.06)比較，si-ERβ組T24細(xì)胞中ERβ相對(duì)表達(dá)量(0.08±0.01)降低(t=12.001、14.415，P<0.001)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組T24細(xì)胞中ERβ相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.307，P=0.763)。見(jiàn)圖4、5。

2.4沉默ERβ對(duì)T24細(xì)胞侵襲、遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)：與空白對(duì)照組[(59.43±2.64)mm]和陰性對(duì)照組[(60.74±2.57)mm]比較，si-ERβ組T24細(xì)胞0～24 h二維遷移距離[(25.75±1.83)mm]短(t=29.656、31.369，P<0.001)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組T24細(xì)胞0～24 h二維遷移距離比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.006，P=0.330)。見(jiàn)圖6。

圖2 膀胱癌細(xì)胞T24和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1中ERβ表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of ERβ expression levels between bladder cancer cell line T24 and normal bladder epithelial cells SV-HUC-1Note: Comparison on two groups，*.P<0.05.

圖3 膀胱癌細(xì)胞T24和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1中ERβ的Western blot電泳圖Fig.3 Western blot results of ERβ between bladder cancer cell line T24 and normal bladder epithelial cells SV-HUC-1

圖4 三組T24細(xì)胞中ERβ水平比較Fig.4 ERβ expression levels of cell line T24 in three groupsNote: Compared with blank control group，*.P<0.05;compared with negative control group，#.P<0.05.

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，si-ERβ組T24細(xì)胞侵襲和遷移能力降低(t=13.814、13.415、14.011、14.316，P<0.001)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組T24細(xì)胞侵襲和遷移能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.157、0.109；P=0.877、0.915)。見(jiàn)表2和圖7。

圖5 三組T24細(xì)胞中ERβ的Western blot電泳圖Fig.5 Western blot results of ERβ in cell line T24 in three groupsNote: A.Blank control group；B.Negative control group；C.si-ERβ group.

圖6 三組T24細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×25)Fig.6 Transwell chamber trail on cell line T24 in three groups (×25)Note: A.Blank control group；B.Negative control group；C.si-ERβ group.

表2 三組T24細(xì)胞侵襲遷移細(xì)胞數(shù)比較

Tab.2 Cell amount comparsion of migration cell line T24 in three groups

GroupsnInvasion numberMigration numberBlank control group8412.43±51.25431.64±46.32Negative control group8408.36±52.17429.17±44.27si-ERβ group8135.26±24.371)2)154.25±31.471)2)F101.931119.733P<0.001<0.001

Note:Compared with blank control group,1)P<0.05；compared with negative control group,2)P<0.05.

2.5沉默ERβ對(duì)T24細(xì)胞形態(tài)變化的影響 空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組呈細(xì)長(zhǎng)的梭形樣間充質(zhì)細(xì)胞，si-ERβ組細(xì)胞呈緊湊的多邊形，類(lèi)似上皮樣細(xì)胞特征。見(jiàn)圖8。

2.6沉默ERβ對(duì)T24細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平的影響 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，si-ERβ組T24細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平降低(t=11.024、12.652；9.435、8.050、11.094、11.063，P<0.05)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組T24細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.166、0.352、0.551，P=0.870、0.730、0.590)。見(jiàn)表3和圖9。

圖7 三組T24細(xì)胞侵襲遷移能力(×200)Fig.7 Invasion and migration ability of cell line T24 in three groups(×200)Note: A.Blank control group；B.Negative control group;C.si-ERβ group.

圖8 三組T24細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×400)Fig.8 Change on cell line T24 morphology in three groups (×400)Note: A.Blank control group；B.Negative control group;C.si-ERβ group.

表3 三組T24細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平比較

Tab.3 Expression levels of protein N-cadherin，Vimentin and MMP9 in cell line T24 of three groups

GroupsnN-cadherinVimentinMMP9 proteinBlank control80.64±0.130.78±0.160.71±0.15Negative control80.63±0.110.75±0.180.67±0.14si-ERβ80.12±0.031)2)0.21±0.061)2)0.11±0.031)2)F70.98340.09162.809P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with blank control group，1)P<0.05；compared with negative control group，2)P<0.05.

圖9 三組T24細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白Western blot電泳圖Fig.9 Western bolt results of protein N-cadherin，Vimentin and MMP9 in cell line T24 of three groupsNote: A.Blank control group；B.Negative control group;C,si-ERβ group.

3 討論

我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率逐年升高，是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，對(duì)人們的健康造成嚴(yán)重威脅，男性膀胱癌的發(fā)病率高于女性，其原因可能與性激素及其受體有關(guān)[4]，研究發(fā)現(xiàn)ER信號(hào)途徑與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[5]，ER是核受體超家族成員，是有配體激活的轉(zhuǎn)錄因子；ER包括ERα和ERβ兩種亞型，ERα在膀胱癌組織中表達(dá)降低，ERβ在膀胱癌組織中呈高表達(dá)[6，7]，因此ERβ在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣大學(xué)者的關(guān)注，如Nguyen等[8]研究發(fā)現(xiàn)ERβ在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與膀胱癌的浸潤(rùn)關(guān)系密切；Tan等[9]研究發(fā)現(xiàn)ERβ在膀胱癌中高表達(dá)，ERβ可作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物，并有可能成為膀胱癌的治療靶標(biāo)；Han等[10]研究發(fā)現(xiàn)ERβ是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)后標(biāo)志物，其可抑制鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，并可能成為膀胱癌治療的潛在靶點(diǎn)；Hsu等[11]發(fā)現(xiàn)通過(guò)ERβ敲除或拮抗劑抑制ERβ信號(hào)傳導(dǎo)可防止膀胱癌發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERβ在膀胱癌組織及膀胱癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)，和上述研究結(jié)果一致，表明ERβ可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可使上皮腫瘤細(xì)胞失去極性，降解細(xì)胞和細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞骨架發(fā)生重組，并獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，具有間質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞可引起腫瘤細(xì)胞穿過(guò)組織基底膜，轉(zhuǎn)移播散到遠(yuǎn)處器官，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[12-14]。EMT可以引起細(xì)胞侵襲、遷移等一系列腫瘤學(xué)行為[15]，MMP9為MMP家族成員，可以降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在腫瘤中上調(diào)MMP9表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力[16，17]。RNA干擾技術(shù)可以特異性關(guān)閉或剔除特定基因的表達(dá)，在惡性腫瘤的治療領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，本文通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默膀胱癌細(xì)胞中ERβ水平，觀察其對(duì)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)、侵襲、遷移和N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)RNA可干擾膀胱癌細(xì)胞由細(xì)長(zhǎng)的梭形樣向緊湊的多邊形轉(zhuǎn)化，可降低膀胱癌細(xì)胞中ERβ水平，沉默ERβ可抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移，降低膀胱癌細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、MMP9蛋白水平。細(xì)長(zhǎng)的梭形樣為間充質(zhì)細(xì)胞特征形態(tài)，緊湊的多邊形為類(lèi)似上皮樣細(xì)胞特征形態(tài)，N-cadherin、Vimentin為EMT過(guò)程中的間質(zhì)標(biāo)志物，N-cadherin、Vimentin水平下降表明EMT過(guò)程受到抑制[18，19]。由此分析沉默ERβ水平可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移。

綜上所述，膀胱癌組織中ERβ呈高表達(dá)，沉默ERβ水平可抑制膀胱癌的侵襲、遷移，其機(jī)制可能與ERβ抑制EMT過(guò)程有關(guān)。ERβ有望成為治療膀胱癌的潛在靶點(diǎn)。