蔣端鳳 莫秋玉 林文遠(yuǎn) 張國珍 周 琴 陶利英 何玉嬋 董 敏

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，桂林541001)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種可引起肝細(xì)胞破壞的嗜肝DNA病毒。乙型病毒肝炎是一種全球性傳染性疾病，我國乙肝表面抗原攜帶率高達(dá)7.18%，廣西是乙肝高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率呈逐年增高趨勢[1]。免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia，ITP)，是一種常見自身免疫性出血性疾病，成人年發(fā)病率為5/10萬～10/10萬，60歲以上老年人是該病的高發(fā)群體[2]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是1995年由Sakaguchi等[3]首次報道的一類特殊的T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無反應(yīng)性，在維持自身耐受、免疫穩(wěn)態(tài)和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。研究顯示，HBV感染與血小板減少存在相關(guān)性，除外ITP本身疾病因素、脾功能亢進(jìn)、TPO水平降低等引起血小板減少原因外，乙肝病毒感染可能是血小板減少的原因之一[5，6]。乙肝病毒感染相關(guān)性血小板減少是指伴HBV感染的ITP，是臨床常見血小板減少疾病之一[7]。目前HBV感染相關(guān)性血小板減少相關(guān)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外相關(guān)研究較少。本研究通過檢測HBV感染相關(guān)性血小板減少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康體檢者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2016年11月至2017年11月住院及門診患者34例，體檢中心健康體檢者10例。檢測HBV表面抗原陰性的10例體檢者為正常對照組；參考肝炎病毒相關(guān)性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，納入HBV感染相關(guān)性血小板減少患者12例為實(shí)驗組；參考ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且HBV表面抗原及HBV DNA定量檢測均為陰性，納入ITP患者12例為ITP組；納入的慢性乙型肝炎患者10例為HBV感染組，滿足以下條件：符合慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，未抗病毒治療，血常規(guī)基本正常，無門脈高壓、肝硬化、脾大等脾功能亢進(jìn)的證據(jù)。各組臨床資料見表1。

1.1.2主要試劑和儀器 FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗、APC標(biāo)記的鼠抗人CD25單抗及BD FACSTM Lysing Solution(10×)均購自BD Biosciences公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細(xì)胞分離 所有研究對象用EDTA抗凝管抽取靜脈血2.0 ml，加入PBS液2.0 ml稀釋后，用淋巴分離液常規(guī)分離獲得單個核細(xì)胞，加入FACSTM Lysing Solution(10×)懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×107ml-1。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光染色 取上述懸浮細(xì)胞100 μl，分別加入CD4-FITC、CD25-APC各20 μl，混勻后室溫避光孵育15 min；加入PBS液500 μl混勻，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入0.5 ml PBS充分混勻，懸浮細(xì)胞，4 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.3流式細(xì)胞檢測 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，結(jié)果分析應(yīng)用CellQuest軟件，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，在淋巴細(xì)胞群中以CD4設(shè)門選擇CD4陽性細(xì)胞分析，得出CD4+T淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比。在淋巴細(xì)胞群中以CD25設(shè)門選擇CD25陽性細(xì)胞分析，得出CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比。在CD4陽性T淋巴細(xì)胞群中，以CD25設(shè)門選擇CD25陽性細(xì)胞分析，得出CD4+CD25+占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗組與HBV感染組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 實(shí)驗組外周血CD4+CD25+百分比較HBV感染組降低[(4.05±3.70)%比(5.36±1.64)%，P=0.048<0.05]，CD4+百分比也降低[(24.64±9.80)%比(38.42±7.70)%，P=0.004<0.05]，見表2。兩組CD4+、CD4+CD25+細(xì)胞比例流式檢測結(jié)果，見圖1。

2.2實(shí)驗組與ITP組、正常對照組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 實(shí)驗組的上述指標(biāo)較ITP組、正常對照組，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見表3。

2.3HBV感染組、 ITP組與正常對照組CD4+、CD4+

表1 各組患者的臨床資料

Tab.1 Clinical characteristics of patients in each group

GroupsFemale/male(n)Age(year)HBV DNA(log10 U/ml)Platelet count(×109 L-1)Normal control group(n=10)7/337.6±15.40228±55.0HBV infection group(n=10)3/748.9±10.73.79±2.34212±54.5ITP group(n=12)11/148.2±21.7032.6±28.5Experimental group(n=12)3/954.6±15.02.94±2.5158.6±26.7

圖1 實(shí)驗組、HBV感染組CD4+、CD4+CD25+細(xì)胞比例流式檢測結(jié)果Fig.1 Results of flow cytometry for CD4+ and CD4+CD25+ cells in experimental group and HBV inf-ection group

表2 實(shí)驗組與HBV感染組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比較

Tab.2 Comparison of CD4+，CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+between experimental group and HBV infection group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.804.05±3.7014.97±12.0HBV infection group1038.42±7.705.36±1.6414.36±4.70U16.030.047.5P0.0040.0480.410

表3 實(shí)驗組與ITP組、正常對照組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比較

Tab.3 Comparison of CD4+,CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+in ITP group，HBV infection group and normal control group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.801)4.05±3.701)14.97±12.0ITP group1231.87±12.73.69±2.911.52±6.6Normal control group1031.72±6.63.61±1.211.27±2.8P10.0730.9080.908P20.0750.5750.742

Note:P1.Experimental group vs ITP group；P2.Experimental group vs normal control group.

圖2 Treg細(xì)胞比例與HBV DNA水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between Treg cell proportion and HBV DNA levelNote: r=0.167，P=0.603.

圖3 Treg細(xì)胞比例與血小板計數(shù)的相關(guān)性Fig.3 Correlation between proportion of Treg cells and platelet countNote: r=-0.511，P=0.089.

CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 HBV感染組CD4+CD25+百分比較正常對照組增高[(5.36±1.64)%比(3.61±1.20) %，U=20.0，P=0.023<0.05]，CD4+及CD4+CD25+/CD4+百分比與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ITP組上述指標(biāo)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4相關(guān)性分析 在置信區(qū)間(雙側(cè))，HBV感染相關(guān)性血小板減少患者的Treg細(xì)胞比例與HBV DNA水平無明顯相關(guān)性(r=0.167，P=0.603)，Treg細(xì)胞比例與血小板計數(shù)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.511，P=0.089)，見圖2、3。分析HBV感染患者的Treg細(xì)胞比例與HBV DNA水平無明顯相關(guān)性(r=-0.286，P=0.424)，ITP患者的Treg細(xì)胞比例與血小板計數(shù)無明顯相關(guān)性(r=-0.273，P=0.391)。

3 討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在正常人群外周中表達(dá)率為5%至10%[10]。研究表明Tregs在HBV感染后及慢性乙型肝炎(CHB)患者病程進(jìn)展中扮演重要角色[11]。CHB患者外周血Tregs水平較正常人明顯升高，并同時出現(xiàn)CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少和功能不足，表明Tregs可能通過抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖使機(jī)體對HBV免疫耐受，引起HBV感染的慢性化[12，13]。研究發(fā)現(xiàn)ITP與外周血Tregs缺乏有關(guān)，其數(shù)量減少和/或功能缺陷與自身免疫性疾病的免疫平衡紊亂和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14，15]。乙肝病毒感染相關(guān)性血小板減少癥是臨床常見病之一，其臨床特點(diǎn)既有HBV感染，又符合ITP的診斷，然而發(fā)病機(jī)制尚不明確。

本研究首次檢測了HBV感染相關(guān)性血小板減少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康對照者的外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例在實(shí)驗組低于HBV感染組，提示HBV感染患者在合并ITP后，CD4+CD25+表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，與文獻(xiàn)ITP發(fā)病時Tregs表達(dá)降低相符[16]。CD4+CD25+T細(xì)胞比例在實(shí)驗組與正常對照組無明顯差異，提示ITP在合并HBV感染后，CD4+CD25+表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)；HBV感染組高于正常對照組，與文獻(xiàn)CHB患者Tregs表達(dá)升高相符[17]。綜上，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)可能受乙肝病毒感染相關(guān)免疫耐受與ITP相關(guān)免疫調(diào)節(jié)異常共同的影響。此外，CD4表達(dá)率僅在實(shí)驗組與HBV感染發(fā)現(xiàn)差異，可能與各組未以HBV載量比較分析有關(guān)[18]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示HBV感染相關(guān)性血小板減少患者Tregs比例與血小板計數(shù)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r絕對值>0.5)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，擴(kuò)大病例數(shù)分析可能會得到有意義的相關(guān)性結(jié)果。

對于HBV感染相關(guān)性血小板減少患者的治療仍存在許多問題，常遇到血液病醫(yī)生建議給予抗乙肝病毒治療，而肝病醫(yī)生認(rèn)為未達(dá)到指南推薦的抗乙肝病毒治療指征[9]，會增加費(fèi)用和停藥風(fēng)險，不應(yīng)抗病毒治療。研究表明，抗乙肝病毒治療后CHB患者外周血Tregs表達(dá)水平較治療前明顯下降[19]，ITP患者外周血Tregs表達(dá)水平也與治療效果相關(guān)[20，21]。通過聯(lián)合抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物干預(yù)Tregs表達(dá)水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，達(dá)到治療目的。本研究希望可以通過檢測外周血Tregs比例為本病的聯(lián)合抗病毒治療找到一些依據(jù)，結(jié)果提示外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例減低的本病患者，可能需要聯(lián)合抗乙肝病毒治療。但依據(jù)并不充分，需要進(jìn)一步檢測比較HBV感染但未達(dá)到抗病毒治療指征患者與本病患者的外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例情況，并找出減低的量化標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)然本研究也存在一些缺陷，由于符合HBV感染相關(guān)性診斷的患者十分少見，研究納入病例數(shù)較少。沒有進(jìn)一步將實(shí)驗組和ITP組中血小板減少情況進(jìn)一步細(xì)分為初治和復(fù)發(fā)難治，對結(jié)果可能有一定影響，這也可能解釋本研究中ITP組Treg比例與正常組無明顯差異。此外，Tregs的準(zhǔn)確免疫表型還應(yīng)包括FoxP3、CD127low、CD45RO、CD45RA等[22]，本研究只檢測了具有主要調(diào)節(jié)表型、最常用的CD4+CD25+T細(xì)胞，可能未能完全反映一些體現(xiàn)不同功能的Tregs亞群存在的客觀差異[23]。Tregs相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-2、IL-12等也需要進(jìn)一步檢測以反映Tregs表達(dá)變化及意義[24]。展望未來研究方向，通過進(jìn)一步增加病例數(shù)，檢測更準(zhǔn)確免疫表型并代表不同功能的Tregs亞群，找到在ITP、CHB、HBV感染相關(guān)性血小板減少不同疾病患者中有差異的Tregs亞群，或者能準(zhǔn)確反映疾病免疫狀態(tài)的Tregs相關(guān)細(xì)胞因子，希望通過檢測它們在外周血的量的變化，作為評估疾病病情、療效及判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。