林婉玲,韓迎雪,2,李來(lái)好,3,楊賢慶,吳燕燕,黃 卉,郝淑賢
(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510300; 2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306; 3.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510300)
隨著生活水平的不斷提高,人們?cè)絹?lái)越重視飲食營(yíng)養(yǎng)健康方面的問(wèn)題,對(duì)富含多不飽和脂肪酸食品的需求量越來(lái)越大[1]。淡水魚(yú)脂肪中普遍含有高比例的不飽和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),增加攝入淡水魚(yú)脂肪,可調(diào)節(jié)膳食脂肪酸的平衡,促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,減少疾病發(fā)生,有利于身體健康[2-3]。劉汝萃等[4]對(duì)魚(yú)油軟膠囊展開(kāi)研究,發(fā)現(xiàn)其具有輔助改善記憶功能;馬方等[5]綜述了EPA 和 DHA 降低甘油三酯水平和血小板凝集,改善炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)以及改善血管和心臟血液動(dòng)力學(xué)的功能,從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病起到防治作用;還有研究發(fā)現(xiàn)飼喂魚(yú)油對(duì)小鼠干眼癥有治療和緩解作用[6],而在發(fā)育期補(bǔ)充一定劑量的 DHA可以增強(qiáng)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[7]。
目前已有一些關(guān)于鯉科魚(yú)肌肉脂肪酸方面的研究報(bào)道。孫家娟等[8]研究了鯉魚(yú)肌肉中的脂肪含量及其脂肪酸組成,魏永生等[9]用氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定鯽魚(yú)肌肉脂肪中脂肪酸組成,王甜等[10]應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用法分析鰱魚(yú)與鳙魚(yú)中脂肪酸組成。雖然已有鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸的研究報(bào)道,但對(duì)其脂肪酸相關(guān)性與聚類(lèi)分析未見(jiàn)報(bào)道。本文選擇鳙魚(yú)、縮骨鳙魚(yú)、翹嘴紅鲌、鰱魚(yú)、青魚(yú)和脆肉鯇6種鯉科魚(yú)為原料,通過(guò)測(cè)定6種魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸含量,并進(jìn)行相關(guān)性分析及聚類(lèi)分析,從中篩選出富含不飽和脂肪酸或DHA和EPA的魚(yú)種,為鯉科魚(yú)的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。
鳙魚(yú)(Aristichthysnobilis)、縮骨鳙魚(yú)(Hypophthalmichthysnobilis)、翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)、鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)、青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)和脆肉鯇(Ctenopharyngodonidellus),分別于2018年6月在佛山市水產(chǎn)市場(chǎng)進(jìn)行采樣;三氟化硼-甲醇溶液(14%),上海安譜科學(xué)儀器有限公司;2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)≥99%,美國(guó)Sigma公司;氯仿、甲醇、氯化鈉、正己烷,分析純。
QP2010 plus氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀,日本島津公司;HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm),安捷倫科技有限公司;IKA-T25組織勻漿機(jī),德國(guó)IKA公司;HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱; TDZ5-WS低速離心機(jī);氮吹儀,美國(guó)Organomation公司。
1.2.1 樣品前處理
取6種鯉科魚(yú)背部肌肉,用流動(dòng)水沖洗后絞碎,備用。
1.2.2 脂肪的提取
脂肪的提取根據(jù)Folch等[11]的方法略作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的絞碎魚(yú)肉于具塞離心管中,加入15 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液(含0.01%BHT),在冰浴條件下用高速分散均質(zhì)機(jī)勻漿2次(10 000 r/min,2×15 s,間隔30 s),然后定容至30 mL,靜置1 h后過(guò)濾,直接將濾液盛放到具塞離心管中,加入0.2倍體積的0.85%生理鹽水,最后在3 000 r/min的條件下離心15 min,棄去上層水與甲醇等液體雜質(zhì),下層脂質(zhì)溶液用氮?dú)獯祾叱ビ袡C(jī)試劑,冷卻至恒重,得到濃縮脂質(zhì)。
1.2.3 脂肪酸組成分析
甲酯化:將1.2.2得到的濃縮脂質(zhì)加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液,在60℃水浴中進(jìn)行甲酯化反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫,然后分別加入1 mL正己烷和蒸餾水,振蕩1 min。靜置分層后,吸取上層有機(jī)層,過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后進(jìn)樣品瓶,直接用GC-MS進(jìn)行分析測(cè)定。
GC條件:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序?yàn)?10℃保持4 min,以10℃/min升到160℃,保持1 min,然后以4℃/min升到210℃,保持3 min,最后以4℃/min升到240℃,保持8 min;采用恒速模式,流量1.52 mL/min,分流比30∶1;進(jìn)樣量1 μL;載氣為氦氣。
MS條件:離子源溫度200℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍(m/z)40~550;溶劑延遲時(shí)間3 min。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理
脂肪酸分析利用計(jì)算機(jī)NIST 0.5譜庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,通過(guò)與MS圖庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比較,確認(rèn)淡水魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸組成,用面積歸一化法確定脂肪酸的相對(duì)含量。每種魚(yú)肌肉脂肪樣品測(cè)定3個(gè)平行,上述所有數(shù)據(jù)均采用Excel計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,采用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析與聚類(lèi)分析。
利用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸組成進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪中共檢出23種脂肪酸,其中10種飽和脂肪酸(SFA),6種單不飽和脂肪酸(MUFA)和7種多不飽和脂肪酸(PUFA)。SFA含量在23.83%~36.35%之間,MUFA含量在30.87%~54.34%之間,PUFA含量在17.92%~35.07%之間。本研究中,鯉科魚(yú)肌肉脂肪中PUFA+MUFA>SFA,且PUFA>17.00%。相對(duì)于其他肉蛋類(lèi)食品[12],具有較高比例的不飽和脂肪酸。
表1 6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸組成及含量%
脂肪酸鳙魚(yú)縮骨鳙魚(yú)翹嘴紅鲌?chǎng)桇~(yú)青魚(yú)脆肉鯇C12∶00.130.390.120.150.030.03C13∶00.080.020.040.140.010.01C14∶03.661.271.432.531.041.12C15∶01.040.250.210.950.120.12C16∶021.0018.5018.4024.3016.7020.90C17∶01.250.280.220.760.140.11C18∶08.105.586.566.025.265.13C20∶00.580.350.390.480.310.23C22∶00.320.100.220.140.140.05C24∶00.190.060.170.060.080.03SFA36.3526.8027.7635.5323.8327.73C14∶10.110.050.050.180.050.06C16∶110.403.953.997.025.167.13
續(xù)表1%
脂肪酸鳙魚(yú)縮骨鳙魚(yú)翹嘴紅鲌?chǎng)桇~(yú)青魚(yú)脆肉鯇C18∶117.6035.9031.0035.3043.2045.40C20∶11.511.851.052.681.271.55C22∶10.710.250.680.210.150.13C24∶10.540.180.410.140.100.07MUFA30.8742.1837.1845.5349.9354.34C18∶24.2621.6020.804.2819.2013.10C18∶35.452.451.795.031.771.01C20∶20.531.061.010.570.740.75C20∶31.351.412.391.251.310.83C20∶44.761.733.312.341.421.65C20∶5(EPA)7.810.620.972.600.190.08C22∶6(DHA)8.462.044.802.721.510.50PUFA32.6230.9135.0718.7926.1417.92EPA+DHA16.272.665.775.321.700.58
由表1可知,鯉科魚(yú)肌肉脂肪的飽和脂肪酸由C12∶0、C13∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0和C24∶0組成,其中含量最高的是C16∶0,其次是C18∶0和C14∶0,其余飽和脂肪酸含量較少。雷琳[13]、盛曉風(fēng)[14]等分別對(duì)野生淡水魚(yú)和養(yǎng)殖淡水魚(yú)的脂肪酸研究發(fā)現(xiàn),飽和脂肪酸中C16∶0含量分別為13.35%~21.88%、17.84%~25.78%,在飽和脂肪酸中含量最高。6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的飽和脂肪酸含量排序?yàn)椋瑚~(yú)(36.35%)>鰱魚(yú)(35.53%)>翹嘴紅鲌(27.76%)>脆肉鯇(27.73%)>縮骨鳙魚(yú)(26.80%)>青魚(yú)(23.83%)。
由表1可知,鯉科魚(yú)肌肉脂肪的單不飽和脂肪酸由C14∶1、C16∶1、C18∶1、C20∶1、C22∶1和C24∶1組成,其中含量最高的是C18∶1,其次是C16∶1和C20∶1,其余單不飽和脂肪酸含量較少。馬旭婷等[15]發(fā)現(xiàn)美國(guó)鳙魚(yú)和鰱魚(yú)肌肉單不飽和脂肪酸中C18∶1含量為8.39%~10.30%,在單不飽和脂肪酸中含量最高。6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的單不飽和脂肪酸含量排序?yàn)椋捍嗳怩?54.34%)>青魚(yú)(49.93%)>鰱魚(yú)(45.53%)>縮骨鳙魚(yú)(42.18%)>翹嘴紅鲌(37.18%)>鳙魚(yú)(30.87%)。
由表1可知,鯉科魚(yú)肌肉脂肪的多不飽和脂肪酸由C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5和C22∶6組成。6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的多不飽和脂肪酸含量排序?yàn)椋郝N嘴紅鲌(35.07%)>鳙魚(yú)(32.62%)>縮骨鳙魚(yú)(30.91%)>青魚(yú)(26.14%)>鰱魚(yú)(18.79%)>脆肉鯇(17.92%)。
DHA及EPA具有抗衰老、抗血栓、抗過(guò)敏和降血糖等作用[16-17]。EPA和DHA兩種脂肪酸被認(rèn)為對(duì)人體具有重要的營(yíng)養(yǎng)及生理活性作用[18]。人類(lèi)膳食的脂肪酸大多來(lái)源于陸生動(dòng)植物,普遍存在ω-3攝入不足、ω-6攝入比率超標(biāo)的狀況[19-20],魚(yú)油及魚(yú)肝油制品是EPA和DHA最佳來(lái)源。因此,高比例EPA和DHA食用魚(yú)也是人類(lèi)飲食所需,高含量EPA和DHA也是評(píng)判魚(yú)中脂肪酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值重要標(biāo)準(zhǔn)。由表1可知,6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪中EPA和DHA總量排序?yàn)椋瑚~(yú)(16.27%)>翹嘴紅鲌(5.77%)>鰱魚(yú)(5.32%)>縮骨鳙魚(yú)(2.66%)>青魚(yú)(1.70%)>脆肉鯇(0.58%)。
采用IBM SPSS Statistics 22.0處理脂肪酸原始數(shù)據(jù),得到各脂肪酸相關(guān)系數(shù)方陣,由于數(shù)據(jù)較多,僅取顯著相關(guān)的脂肪酸相關(guān)性數(shù)據(jù)(其他數(shù)據(jù)隱去)進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知:C14∶0與C15∶0、C17∶0、C20∶0、C18∶3呈極顯著正相關(guān),與C18∶0、C16∶1、C20∶4、C22∶6(DHA)呈顯著正相關(guān);C15∶0與C13∶0、C17∶0、C20∶0、C18∶3呈極顯著正相關(guān),與C14∶1呈顯著正相關(guān);C16∶0與C13∶0、C14∶1呈顯著正相關(guān);C17∶0與C20∶0、C18∶3呈極顯著正相關(guān),與C18∶0、C22∶6(DHA)呈顯著正相關(guān);C18∶0與C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān);C20∶0與C18∶0、C22∶6(DHA)呈顯著正相關(guān);C22∶0與C18∶0、C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān),與C20∶0呈顯著正相關(guān);C24∶0與C22∶0、C22∶1、C24∶1、C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān),與C18∶0、C20∶4呈顯著正相關(guān);C14∶1與C13∶0呈極顯著正相關(guān),與C18∶3呈顯著正相關(guān);C22∶1與C22∶0、C24∶1、C20∶4、C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān),與C18∶0呈顯著正相關(guān);C24∶1與C18∶0、C22∶0、C20∶4、C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān);C18∶2與C20∶2呈極顯著正相關(guān);C18∶3與C20∶0呈極顯著正相關(guān),與C13∶0呈顯著正相關(guān);C20∶4與C18∶0、C22∶0、C22∶6(DHA)呈極顯著正相關(guān),與C20∶0呈顯著正相關(guān);C20∶5(EPA)與C14∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0呈極顯著正相關(guān),與C15∶0、C22∶0、C16∶1、C18∶3、C20∶4、C22∶6(DHA)呈顯著正相關(guān);而C14∶0與C18∶1、C18∶2呈顯著負(fù)相關(guān);C15∶0與C18∶2呈顯著負(fù)相關(guān);C16∶0與C18∶2呈顯著負(fù)相關(guān);C17∶0與C18∶1、C18∶2呈顯著負(fù)相關(guān);C24∶0與C18∶1呈顯著負(fù)相關(guān);C14∶1與C18∶2呈顯著負(fù)相關(guān);C18∶1與C18∶0、C20∶0、C22∶0、C24∶1、C20∶4、C22∶6(DHA)呈極顯著負(fù)相關(guān),與C22∶1呈顯著負(fù)相關(guān);C18∶2與C16∶1、C18∶3呈顯著負(fù)相關(guān);C20∶5(EPA)與C18∶1呈顯著負(fù)相關(guān)。脂肪酸間呈顯著正相關(guān)的意義在于魚(yú)體通過(guò)食物或其他途徑來(lái)源等比例增加或補(bǔ)充脂肪酸,反之脂肪酸間呈顯著負(fù)相關(guān)表示脂肪酸間在魚(yú)體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系[21]。
鯉科魚(yú)肌肉脂肪中脂肪酸含量較高的C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶4與C20∶5(EPA)、C22∶6(DHA)間的關(guān)系:C16∶0、C18∶2與C20∶5(EPA)、C22∶6(DHA)均無(wú)顯著相關(guān),無(wú)法確定其關(guān)系;C18∶0與C20∶4(r=0.988)、C20∶5(EPA)(r=0.924)和C22∶6(DHA)(r=0.994)均呈極顯著正相關(guān),C20∶4與C22∶6(DHA)(r=0.981)呈極顯著正相關(guān),C20∶5(EPA)與C16∶1(r=0.833)、C18∶3(r=0.852)、C20∶4(r=0.883)和C22∶6(DHA)(r=0.895)均呈顯著正相關(guān),表明這8對(duì)脂肪酸含量變化趨勢(shì)是一致的,隨相同因素的增加而增加或隨相同因素的減少而減少;C18∶2與C16∶0(r=-0.854)、C16∶1(r=-0.886)和C18∶3(r=-0.814)均呈顯著負(fù)相關(guān),表明C18∶2與這3種脂肪酸在魚(yú)體間可穩(wěn)定而快速地互相轉(zhuǎn)化以達(dá)到平衡;C18∶1與C20∶5(EPA)(r=-0.899)呈顯著負(fù)相關(guān),C18∶1與C18∶0(r=-0.982)、C20∶4(r=-0.953)和C22∶6(DHA)(r=-0.979)均呈極顯著負(fù)相關(guān),表明C20∶5(EPA)和C22∶6(DHA)可能主要來(lái)源于魚(yú)體中C18∶1的轉(zhuǎn)化。
表2 各類(lèi)脂肪酸含量間的相關(guān)性分析
續(xù)表2
脂肪酸C14∶0C15∶0C16∶0C17∶0C18∶0C20∶0C22∶0C24∶0C14∶1C18∶1C22∶1C24∶1C18∶2C18∶3C20∶4C20∶5C20∶0-0.938??-0.914??--0.940??--0.842?---0.912??---0.932??0.841??0.901??C22∶0-------0.951??--0.928??0.903??0.944??--0.940??0.832?C14∶1--0.874?0.883?-------------C16∶10.824?------------0.886?--0.833?C18∶1-0.856?---0.849??----0.838?--------0.899?C22∶1-------0.962??--0.872??------C24∶1-------0.957??--0.937??0.981??-----C18∶2-0.839?-0.887?-0.854?-0.821?-----0.868?-------C18∶30.936??0.986??-0.954??----0.841?----0.814?--0.852?C20∶2------------0.909??---C20∶40.833?------0.885?--0.953??0.921??0.956??---0.883?C22∶60.831?--0.812?0.994??0.876?0.977??0.910??--0.979??0.911??0.965??--0.981??0.895?
注:“-”表示隱去的相關(guān)分析數(shù)據(jù);*和**分別表示顯著(相關(guān)系數(shù)|r|=0.800~0.899)和極顯著(|r|=0.900~1.000)相關(guān)。
主成分分析法是用少數(shù)變量盡可能多地反映原來(lái)變量的信息,一般認(rèn)為累積方差貢獻(xiàn)率大于 85%,就可以保留大部分重要信息。通過(guò)IBM SPSS Statistics 22.0將所有脂肪酸原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,得到特征值、主成分方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率,結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化正交旋轉(zhuǎn)法4次迭代后收斂提取主成分,結(jié)果見(jiàn)表4。
表3 鯉科魚(yú)脂肪酸的特征值及方差貢獻(xiàn)率
由表3可知,特征值大于1.000,且累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)94.221%的主成分有3個(gè),說(shuō)明前3個(gè)主成分包含的要素信息量可以反映出大部分信息。由表4可知:第一主成分(P1)主要由C18∶0、C22∶0、C24∶0、C18∶1、C22∶1、C24∶1、C20∶4、C20∶5(EPA)和C22∶6(DHA)9種脂肪酸組成,方差貢獻(xiàn)率為60.335%;第二主成分(P2)主要由C13∶0、C15∶0、C16∶0、C14∶1、C20∶1、C18∶2和C18∶3組成,方差貢獻(xiàn)率為25.350%;第三主成分(P3)主要由C12∶0組成,方差貢獻(xiàn)率為8.536%。可見(jiàn),上述17種脂肪酸(大于0.750)是鯉科魚(yú)肌肉脂肪的主要特征脂肪酸。
表4 主成分矩陣組成
為了驗(yàn)證主成分分析是否符合統(tǒng)計(jì)分析規(guī)律以及了解鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸是否能夠提供分類(lèi)學(xué)足夠的信息量,用IBM SPSS Statistics 22.0對(duì)鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸進(jìn)行了聚類(lèi)分析。由鯉科魚(yú)肌肉脂肪的17種主要特征脂肪酸原始數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。由23種脂肪酸原始數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,結(jié)果與圖1一致,說(shuō)明主成分分析符合統(tǒng)計(jì)分析規(guī)律。圖1以樹(shù)狀圖在距離10分成2組:第一組為縮骨鳙魚(yú)、翹嘴紅鲌、青魚(yú)和脆肉鯇?zhuān)渲星圄~(yú)和脆肉鯇符合傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué)的雅羅魚(yú)亞科魚(yú)種;第二組為鳙魚(yú)和鰱魚(yú),符合傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的鰱屬魚(yú)種。本研究的鯉科魚(yú)按聚類(lèi)分析分成2組,基本符合傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué)的分類(lèi),但若按傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué),翹嘴紅鲌為鲌亞科鲌屬,本應(yīng)在聚類(lèi)分析中自成一組(屬);縮骨鳙魚(yú)為鰱屬,本應(yīng)在聚類(lèi)分析中第二組,而樹(shù)狀圖中顯示翹嘴紅鲌和縮骨鳙魚(yú)都在第一組,表明鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸組成及含量尚不能提供分類(lèi)學(xué)足夠的信息量。
圖1 6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸聚類(lèi)分析
6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪共檢出23種脂肪酸,其中10種飽和脂肪酸(SFA)、6種單不飽和脂肪酸(MUFA)和7種多不飽和脂肪酸(PUFA)。SFA含量在23.83%~36.35%之間,MUFA含量在30.87%~54.34%之間,PUFA含量在17.92%~35.07%之間。6種鯉科魚(yú)肌肉脂肪的脂肪酸中均含有較高比例的不飽和脂肪酸,其中鳙魚(yú)中C20∶4(花生四烯酸,ARA)、EPA和DHA含量普遍較高,翹嘴紅鲌和鰱魚(yú)EPA和DHA含量次之,脆肉鯇中EPA和DHA含量最少。