陳 煜，龔號(hào)迪，張 龑，趙貝貝，陳志成

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 南通 226006)

油炸是食品熟化方式的一種，油炸食品以其良好的膨松質(zhì)構(gòu)、獨(dú)特的香味及滑爽的口感深受人們喜愛。但馬鈴薯、甘薯、面粉等富含淀粉的食物在油炸過程中，極易產(chǎn)生一種有害的化學(xué)物質(zhì)——丙烯酰胺[1-3]。研究表明，天門冬酰胺參與的美拉德反應(yīng)是導(dǎo)致丙烯酰胺產(chǎn)生的重要途徑[4-6]。國際癌癥機(jī)構(gòu)將丙烯酰胺列為“人類可能的致癌物”(2A類)[7]。

丙烯酰胺的檢測方法包括氣相色譜、液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)，近年來新型的基于褐變的快速測定、毛細(xì)管電泳、酶聯(lián)免疫、生物傳感器等技術(shù)也得到了發(fā)展[8-10]，其中以液相色譜(HPLC)及其聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用最為廣泛[11-12]。GB/T 5009.204—2005采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測食品中的丙烯酰胺。陰永潑等[13]采用QuEChERS前處理淀粉類食品樣品，再用高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測丙烯酰胺。該方法檢出限低(可低至1 μg/kg)，靈敏度高，但儀器價(jià)格昂貴，檢測費(fèi)用較高，不易推廣。邵美麗等[14]采用固相萃取-高效液相色譜法檢測油炸豬肉中丙烯酰胺，檢出限6 μg/kg，加標(biāo)回收率90%～92%，該法可有效檢測油炸豬肉中的丙烯酰胺含量，但前處理較煩瑣。

鑒于國內(nèi)對于丙烯酰胺的HPLC分析仍不完善，本試驗(yàn)擬建立油炸食品中丙烯酰胺的提取、分離、純化及HPLC分析方法，便于油炸食品中丙烯酰胺的快速檢測，此外，對谷物科學(xué)、油脂化學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)一步研究也具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市售薯片、鍋巴、麻花(河南鄭州家樂福超市)。正己烷、乙酸乙酯、七水合硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、Carrez試劑(分析純)，乙腈(色譜純),丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(天津市化學(xué)試劑研究所)，C18固相萃取小柱(安捷倫科技中國有限公司)，Milli-Q超純水。

760 CRT型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，CLF-10C型密封性搖擺式粉碎機(jī)(浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)，DT5-4B型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)，MTN-2800D型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，MVS-1型旋渦混合器(北京金北德工貿(mào)有限公司)，KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，固相萃取裝置(天津博納艾杰爾)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用超純水配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾膜后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)HPLC分析，繪制質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系曲線。

1.2.2 樣品前處理

一定量的油炸食品經(jīng)100℃干燥2 h后，用粉碎機(jī)粉碎。稱取5.0 g(精確至0.01 g)于100 mL燒杯中，加入40 mL去離子水，磁力攪拌30 min。轉(zhuǎn)移至離心管中，3 000 r/min條件下離心30 min。取上清液，加入10 mL正己烷萃取，以除去脂溶性物質(zhì)，重復(fù)萃取3次。脫脂后的樣品中加入Carrez Ⅰ試劑與CarrezⅡ試劑各2 mL，凈化20 min以除去樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。將凈化后的樣品離心(10 min、4 000 r/min)，取上清液5 mL過C18固相萃取小柱，并用10 mL乙酸乙酯洗脫，將洗脫液氮吹濃縮至干，加入1 mL超純水，旋渦混合，使丙烯酰胺充分溶解[15-16]。待HPLC檢測。

1.2.3 HPLC條件

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技中國有限公司)，Agilent ZORBAX SB-C18高效液相色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，安捷倫科技中國有限公司)。流動(dòng)相乙腈-水。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 紫外檢測波長的選擇

采用雙光束紫外-可見分光光度計(jì)對10 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，得到丙烯酰胺的紫外-可見分光光度計(jì)全波長掃描圖如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺的紫外-可見光譜圖

由圖1可知，丙烯酰胺的最大吸收波長在195 nm處，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在該處的吸光度為1.976，故選擇195 nm為丙烯酰胺的最佳檢測波長。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

丙烯酰胺是強(qiáng)極性化合物，流動(dòng)相比例對其色譜峰形和出峰時(shí)間有較大影響。在檢測波長195 nm、流速1.0 mL/min、進(jìn)樣量20 μL、柱溫45℃的條件下，考察乙腈-水體積比分別為5∶95、10∶90、20∶80、30∶70時(shí)的色譜分離效果，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在乙腈與水體積比分別為10∶90、20∶80條件下，丙烯酰胺吸收峰基線分離效果較好，考慮到乙腈與水體積比在20∶80時(shí)，丙烯酰胺出峰時(shí)間較10∶90的短，故選擇最佳流動(dòng)相為乙腈-水(體積比20∶80)。

2.1.3 柱溫的選擇

在檢測波長195 nm、進(jìn)樣量20 μL、流速1.0 mL/min、流動(dòng)相乙腈-水(體積比20∶80)條件下，考察柱溫分別為20、35、40、45℃時(shí)的色譜分離效果，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，不同柱溫條件下，丙烯酰胺色譜峰均能實(shí)現(xiàn)基線分離。柱溫由20℃升至45℃，由于傳質(zhì)速度加快，出峰時(shí)間由1.819 min縮短至1.768 min。柱溫45℃時(shí)，峰形較好，且出峰時(shí)間相對較短，因此選擇丙烯酰胺色譜分離最佳柱溫45℃。

2.1.4 流速的選擇

在檢測波長195 nm、柱溫45℃、進(jìn)樣量20 μL、流動(dòng)相為乙腈-水(體積比20∶80)條件下，考察流速分別為0.5、0.8、1.0、2.0 mL/min時(shí)的色譜分離效果，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著流速的增加，丙烯酰胺吸收峰的出峰時(shí)間縮短。但流速增大至2.0 mL/min時(shí)，丙烯酰胺吸收峰未能實(shí)現(xiàn)基線分離。流速在1.0 mL/min時(shí)出峰時(shí)間1.770 min，且峰形較好，因此選擇丙烯酰胺色譜分離最佳流速1.0 mL/min。

2.1.5 進(jìn)樣量的選擇

在檢測波長195 nm、柱溫45℃、流速1.0 mL/min、流動(dòng)相為乙腈-水(體積比20∶80)條件下，考察進(jìn)樣量分別為5、10、20、30 μL時(shí)的色譜分離效果，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，出峰時(shí)間1.600 min，進(jìn)樣量增加至30 μL時(shí)，出峰時(shí)間延長至1.824 min。但進(jìn)樣量5 μL時(shí)靈敏度較低，進(jìn)樣量10 μL時(shí)，丙烯酰胺峰與雜質(zhì)峰未能實(shí)現(xiàn)基線分離。進(jìn)樣量20 μL時(shí)，丙烯酰胺峰與雜質(zhì)峰完全分離，且峰形較好，故選擇丙烯酰胺進(jìn)樣量20 μL。

2.1.6 最佳色譜條件

綜合上述色譜條件的優(yōu)化與選擇，確定測定丙烯酰胺的色譜條件為：檢測波長195 nm，流動(dòng)相乙腈-水(體積比20∶80)，柱溫45℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。在此條件下，丙烯酰胺可與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)基線分離，丙烯酰胺的出峰時(shí)間為1.770 min。

2.2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

將0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述最佳色譜條件進(jìn)樣。以丙烯酰胺的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程。得到的線性回歸方程為y=345.56x+17.371，r2=0.998 2。

2.3 檢出限與精密度

在最佳色譜條件下，以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，得到該方法的檢出限為5 μg/kg。

分別配制質(zhì)量濃度為1.0、10、1 000 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照樣，在最佳色譜條件下進(jìn)樣測定，每個(gè)質(zhì)量濃度測定3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表1所示。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，RSD在0.12%～0.46%，小于0.5%，說明該方法的精密度良好。

2.4 樣品的加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)粉碎的薯片樣品4份各5.0 g，向其中3份中分別準(zhǔn)確加入0.5 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一份作為空白對照，按1.2.2進(jìn)行樣品前處理操作，在最佳液相色譜條件下檢測分析，計(jì)算得到樣品的加標(biāo)回收率分別為88.5%、90.2%、90.6%。

2.5 實(shí)際樣品測定

將市售薯片、麻花、鍋巴樣品按照1.2.2進(jìn)行前處理，并在最佳色譜條件下檢測分析。得到薯片、鍋巴、麻花3種油炸食品中丙烯酰胺的含量分別為731.2、592.3、441.0 μg/kg。均低于世界衛(wèi)生組織規(guī)定的食品中丙烯酰胺含量不得超過1 mg/kg的規(guī)定。

3 結(jié) 論

建立了油炸食品中丙烯酰胺的提取、分離、純化與液相色譜分析方法。油炸食品經(jīng)干燥、研磨、水提后用正己烷除去油脂，用Carrez試劑除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用C18固相萃取小柱純化、洗脫后得到丙烯酰胺提取液。采用高效液相色譜法分析丙烯酰胺，研究了不同的流動(dòng)相比例、柱溫、流速、進(jìn)樣量對丙烯酰胺分離效果的影響。得到丙烯酰胺的最佳分離條件為：檢測波長195 nm，流動(dòng)相乙腈-水(體積比20∶80)，柱溫45℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。該方法丙烯酰胺的檢出限為5 μg/kg，RSD在0.5%范圍內(nèi)，薯片樣品的加標(biāo)回收率在88.5%～90.6%之間，該法能有效、快速測定油炸食品中丙烯酰胺的含量。