陳遠(yuǎn)群 諶 平 陳國(guó)創(chuàng) 韋枝紅

1.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院深圳市第二人醫(yī)院婦科，廣東深圳 518035；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東深圳 518055；3.廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院（原深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院深圳市第二人醫(yī)院）婦科，廣東深圳 518101

卵巢癌是婦科惡性腫瘤死亡率最高的一種[1-2]，其高死亡率除了因早期發(fā)現(xiàn)困難，更重要是其晚期化療效果不佳[3-4]。大多數(shù)卵巢癌細(xì)胞在經(jīng)歷鉑類等細(xì)胞毒性藥物治療后，均出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)克隆適應(yīng)性進(jìn)化[5-7]，耐藥性的出現(xiàn)。因此，我們急需建立一種有效、安全的卵巢癌晚期治療方案，單克隆抗體療法中的雙特異性T 細(xì)胞銜接器（BiTE）的獨(dú)特功能為婦科腫瘤免疫治療中明星分子[8-10]。本實(shí)驗(yàn)主要選擇靶向上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM），作為卵巢癌細(xì)胞特異的上皮黏附因子及T 細(xì)胞特異黏附因子CD3，作為BiTE 的兩個(gè)特異抗體。采用非病毒載體微環(huán)DNA 表達(dá)系統(tǒng)獲取蛋白。觀察抗EpCAM 加抗CD3 雙特異BiTE 分子蛋白（抗EpCAM/抗CD3 BsAb）對(duì)誘導(dǎo)T 細(xì)胞特意殺傷卵巢癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-red，美國(guó)）；倒置生物顯微鏡（OLYMPUS，日本）；Bright-GloTM螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（Promega，E2610）；分選型流失細(xì)胞儀（BD Cano Ⅱ）；動(dòng)態(tài)光散射粒徑測(cè)試儀（Malvern，英國(guó)）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）；Anti-6*His tag antibody（Abcam，美國(guó)）；蛋 白顯影液（Cell Signaling，美國(guó)）；PVDF 膜（Millipore，美國(guó)），anti-rabbit IgG（Cell Signaling，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 的制備 采用X-treme-GENE HP DNA transfection reagent 和表達(dá)載體SZ-90 EpCAMxCD3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，使用Expi293表達(dá)培養(yǎng)基獲得大量含有表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清。收集上清液進(jìn)行蛋白的檢測(cè)。

1.2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 的純化 用cOmplete His-Tag Resin 和?KTA 蛋白純化系統(tǒng)分離純化BsAb抗體。采用Werstern blot 技術(shù)。將抗EpCAM/抗CD3 BsAb 表達(dá)上清液和HEK293 細(xì)胞裂解液，加入5×蛋白loading buffer 混合。轉(zhuǎn)膜，切取蛋白Marker 在14～97 kD 的位置，將其覆蓋在PVDF 膜的負(fù)極方向，將混合液滴加到膜上并進(jìn)行曝光成像。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BiTE 對(duì)T 細(xì)胞和EpCAM+腫瘤細(xì)胞的選擇性結(jié)合，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向性檢測(cè) 抗體分別和（A）T 細(xì)胞、（B）CaOV3-luc 細(xì)胞孵育，后加入APC-conjugated anti-His 抗體作為二抗，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.4 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導(dǎo)T 細(xì)胞對(duì)人卵巢癌CaOV3 的細(xì)胞毒性作用 本實(shí)驗(yàn)分4 組進(jìn)行觀察：T 細(xì)胞組、卵巢癌細(xì)胞組、T 細(xì)胞加卵巢癌細(xì)胞組以及抗體加T 細(xì)胞加卵巢癌細(xì)胞組。T 細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞和抗體孵育。分別用碘化丙啶（PI）和Calcein-AM復(fù)染，將PI+Calcein-AM 培養(yǎng)，分別在光鏡以及倒置熒光顯光顯微鏡觀察，并采用電腦合成圖像把PI 和Calcein-AM 染色圖像融合于一圖中觀察。

1.2.5 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導(dǎo)T 細(xì)胞殺傷卵巢癌CaOV3 細(xì)胞 效靶比為10∶1，T 細(xì)胞、CaOV3-luc細(xì)胞和抗體共孵育6 h 和12 h，培養(yǎng)基：98McCoy 5a +1FBS+1 青/鏈霉素雙抗，ONE-GloTM螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒檢測(cè)抗EpCAM/抗CD3 BsAb 介導(dǎo)的T 細(xì)胞毒性作用。Promega GloMax 96 微孔板發(fā)光檢測(cè)儀設(shè)置：讀取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 體外表達(dá)

采用蛋白電泳分離細(xì)胞上清液中抗體，見(jiàn)抗體外表達(dá)成功，分子量約為59 kD，無(wú)其他雜帶出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 抗體表達(dá)

2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 體外表達(dá)提純

使用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)順利提純抗體。見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗EpCAM/抗CD3 BsAb 可分別靶向結(jié)合T 細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向結(jié)合T 細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 單一T 細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（MFI）：1587。抗體加T 細(xì)胞后的MFI：24 625。由圖可見(jiàn)未結(jié)合抗體的T細(xì)胞與結(jié)合抗體T 細(xì)胞在流式細(xì)胞儀下明顯區(qū)分，提示抗體能夠靶向結(jié)合T 細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖2 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 抗體的Western blot 檢測(cè)

圖3 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 與T 細(xì)胞特異性結(jié)合

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb 靶向結(jié)合卵巢癌細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 單一卵巢癌細(xì)胞的MFI：1809?？贵w加卵巢癌細(xì)胞后的MFI：84526。由圖可見(jiàn)未結(jié)合抗體的卵巢癌細(xì)胞與結(jié)合抗體卵巢癌細(xì)胞在流式細(xì)胞儀下明顯區(qū)分，提示抗體能夠靶向結(jié)合卵巢癌細(xì)胞。見(jiàn)圖4。

2.4 抗體介導(dǎo)T 細(xì)胞對(duì)人卵巢癌的細(xì)胞毒性作用的形態(tài)學(xué)變化

2.4.1 光鏡和Calcein-AM 染色圖 見(jiàn)T cells+CaOV3腫瘤細(xì)胞均散在分布，少許T 細(xì)胞圍繞腫瘤細(xì)胞。T cells +SKOV-3+抗體圖：T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞聚集成塊的卵巢癌腫瘤-T 細(xì)胞團(tuán)，散在T 細(xì)胞較少。見(jiàn)圖5。

2.4.2 PI 染色圖 卵巢癌細(xì)胞和T 細(xì)胞組：少量卵巢癌細(xì)胞及少量T 細(xì)胞被PI 染色，說(shuō)明卵巢癌細(xì)胞和T 細(xì)胞中有少量死細(xì)胞。T cells+CaOV3 組見(jiàn)死亡細(xì)胞增多并聚集。T cells +SKOV-3+抗體組：T 細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞大量聚集，并成塊的卵巢癌腫瘤-T 細(xì)胞團(tuán)，死亡細(xì)胞明顯增加。見(jiàn)圖5。

圖4 BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 與卵巢癌細(xì)胞CaOV3-luc cells特異性結(jié)合

2.4.3 融合圖 增加抗體后的卵巢癌細(xì)胞死亡細(xì)胞數(shù)較明顯增多，并聚集成團(tuán)。見(jiàn)圖5。

2.5 抗體對(duì)于誘導(dǎo)T 細(xì)胞殺傷卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞特異性殺傷率隨時(shí)間以及濃度的變化情況

抗體對(duì)于誘導(dǎo)T 細(xì)胞殺傷卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞特異性殺傷率隨時(shí)間的延長(zhǎng)效果不是一直增強(qiáng)?？贵w的濃度低于1×10-6μg/mL 時(shí)，6 h 的特異性殺傷率與12 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而濃度升高時(shí)，12 h 的效果較6 h 更強(qiáng)，隨著劑量的增加而殺傷效果更好，直到濃度到達(dá)1×10-3μg/mL，出現(xiàn)效果下降。抗體的濃度≥1×10-5μg/mL 時(shí)，兩個(gè)時(shí)間的特異殺傷率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩個(gè)不同時(shí)間的特異殺傷率均在1×10-4μg/mL 的濃度時(shí)，殺傷效率最強(qiáng)。見(jiàn)表1。

3 討論

卵巢癌是婦科死亡率第一[11]的惡性腫瘤。耐藥及殺傷自身健康細(xì)胞是造成其高死亡率的重要原因之一[12]。近年來(lái)，癌癥的免疫治療在血液系統(tǒng)等惡性腫瘤治療中取得卓越的成就[13-14]，免疫治療的巨大優(yōu)越性讓其在腫瘤化療治療中成為研究的熱點(diǎn)[15-16]。傳統(tǒng)的抗體基因療法中抗體半衰期短，技術(shù)要求高精阻礙免疫治療的推廣。本研究采用的非病毒載體的微環(huán)DNA 可以在同等條件下實(shí)現(xiàn)持續(xù)表達(dá)。微環(huán)DNA 能在體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定、高效地表達(dá)目的基因且?guī)缀鯚o(wú)毒性。目前本實(shí)驗(yàn)所使用的微環(huán)DNA 的制備技術(shù)在已實(shí)現(xiàn)安全、無(wú)毒、高質(zhì)量的規(guī)?；苽鋄17]并取得中國(guó)專利201510859263.2。

圖5 Calcein-AM 和PI 雙染色觀察細(xì)胞凋亡情況（標(biāo)尺：200μm）

表1 不同濃度BiTE-anti-EpCAM×anti-CD3 作用不同時(shí)間對(duì)卵巢癌細(xì)胞的特異殺傷率比較（n=4）

EpCAM 在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)并可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，種植，轉(zhuǎn)移等[7]，本實(shí)驗(yàn)BiTE 的兩種抗體[18]，一靶向腫瘤細(xì)胞EpCAM，另一靶向T 細(xì)胞表面分子CD3，橋接卵巢癌細(xì)胞和T 細(xì)胞，介導(dǎo)特異性殺傷。本實(shí)驗(yàn)可清晰看到非病毒載體MC 系統(tǒng)成功表達(dá)抗Ep-CAM/抗CD3 BsAb。

研究表明腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷主要是通過(guò)雙特異抗體在腫瘤細(xì)胞和T 細(xì)胞之前形成“免疫突觸”[19-20]，起到抗腫瘤的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PI 和Calcein-AM 雙染色，倒置顯微鏡下見(jiàn)T 細(xì)胞+卵巢癌+抗體組中T 細(xì)胞向卵巢癌細(xì)胞的集結(jié)增加，并出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。側(cè)面上證明抗體能夠增強(qiáng)誘導(dǎo)T 細(xì)胞靶向殺傷卵巢癌細(xì)胞。

觀察升高濃度和延長(zhǎng)時(shí)間下，抗體對(duì)于誘導(dǎo)T 細(xì)胞的特異殺傷率并不是無(wú)限增強(qiáng)。在同樣6 h 的作用下抗體濃度高于1×10-7μg/mL 后，隨著濃度的上升，特異殺傷率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但這樣的趨勢(shì)并不是無(wú)限的延伸；在濃度1×10-3μg/mL 后，才出現(xiàn)特異殺傷效果下降。在濃度達(dá)1×10-6μg/mL 之前，6 h 的特異殺傷率較高；濃度達(dá)1×10-6μg/mL 后12 h 的殺傷較6 h 的殺傷率高。濃度在1×10-4μg/mL時(shí)，兩時(shí)間均達(dá)到最大的殺傷。也可以理解，在使用抗體濃度方面需要，1×10-5μg/mL～1×10-4μg/mL 持續(xù)時(shí)間12 h 時(shí)，抗體誘導(dǎo)T 細(xì)胞殺傷卵巢癌細(xì)胞最強(qiáng)。由此推斷，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 誘導(dǎo)T 細(xì)胞特異性殺傷卵巢癌細(xì)胞具有一定的時(shí)間以及藥物濃度的依賴性，大劑量藥物濃度并不會(huì)提高其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷性，而過(guò)于密集的使用亦不能提高其殺傷性，而是在一定的濃度以及時(shí)間時(shí)間間隔里使用方可提高此抗體誘導(dǎo)T 細(xì)胞特異殺傷卵巢癌。此實(shí)驗(yàn)亦為未來(lái)動(dòng)物以及人體實(shí)驗(yàn)提供一個(gè)濃度以及時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明anti-EpCAM/CD3雙特異抗體具有介導(dǎo)T 細(xì)胞靶向、高效清除卵巢癌細(xì)胞；本實(shí)驗(yàn)所使用的非病毒載體的方法，基于微環(huán)DNA 載體表達(dá)雙特異抗體的抗癌策略的具有可行性，為卵巢癌的免疫治療提供一種可選的基因藥物。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)提出，抗EpCAM/抗CD3 BsAb 誘導(dǎo)T 細(xì)胞殺傷具有一定的時(shí)間以及劑量的依賴性，為未來(lái)臨床試驗(yàn)提供一可行的時(shí)間以及劑量數(shù)據(jù)。