李 俊 李春英

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院甲乳疝外科，廣西柳州 545007；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院病理科，廣西柳州 545007

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長(zhǎng)因子受體（Her-2）陰性的狀態(tài)，在乳腺癌各分子分型中占15%～20%[1]。TNBC 有很強(qiáng)的異質(zhì)性，其遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率和死亡率高于其他各型，但在治療上卻缺乏有效的手段，因而尋找新的靶向標(biāo)志物以指導(dǎo)最佳治療一直是TNBC 研究的焦點(diǎn)[2]。CD44V4 是細(xì)胞黏附分子CD44變異型V 家族中的一員，參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-胞外基質(zhì)之間的特異性黏附，目前發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-4]。nm23 是轉(zhuǎn)移抑制基因，在細(xì)胞增殖、分化、癌變和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，其下調(diào)與許多癌癥預(yù)后不良有關(guān)[5]，其在乳腺癌中的表達(dá)也是判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素[6]。本課題前期的研究已發(fā)現(xiàn)CD44V4 同乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不良臨床病理指標(biāo)有關(guān)，但兩者在TNBC 中的表達(dá)情況及與臨床病理特征的相關(guān)性研究均少見(jiàn)報(bào)道。本研究探討CD44V4和nm23 在TNBC 中的表達(dá)及在腫瘤侵襲性生物學(xué)行為中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年1 月～2015 年3 月廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的浸潤(rùn)性乳腺癌140 例為研究對(duì)象，其中TNBC 患者70 例設(shè)為研究組，非TNBC 患者70 例設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診浸潤(rùn)性乳腺癌，ER、PR、Her-2 檢測(cè)結(jié)果判定及分子分型參照指南標(biāo)準(zhǔn)[7]；②年齡18～73 歲；③術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療，術(shù)后根據(jù)免疫組化結(jié)果接受輔助治療；④臨床病理資料完整且患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。入選患者均為女性，研究組年齡29～68 歲，中位年齡49.5 歲；對(duì)照組年齡32～73 歲，中位年齡54 歲。病理組織學(xué)分級(jí)采用Scarff-Bloom-Richardson 分級(jí)法分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級(jí)。兩組患者年齡、月經(jīng)狀況、病理組織學(xué)分級(jí)及臨床分期等基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 免疫組化檢測(cè)方法

應(yīng)用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法檢測(cè)CD44V4 和nm23，第一抗體CD44V4和nm23 的SP 試劑盒（KIT-5001 批號(hào)：AD06017896，KIT-9710 批號(hào)：180711139a）均由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供，所有操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性切片，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

從每例標(biāo)本石蠟切片中隨機(jī)取5 張進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取不重疊的10 個(gè)高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，2 人雙盲觀測(cè)。CD44V4 陽(yáng)性表達(dá)為胞膜或胞質(zhì)棕黃色均勻染色或呈顆粒狀。結(jié)果判定根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度綜合判斷[8]，按陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，>5%～25%為1 分，>25%～75%為2 分，＞75%為3 分；染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分為無(wú)著色，1 分為淺黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色；取兩項(xiàng)評(píng)分乘積作為總積分，≤1分為陰性，＞1 分為陽(yáng)性。nm23 陽(yáng)性表達(dá)為胞漿中棕黃色顆粒，結(jié)果判定按照綜合染色強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行[9]，染色強(qiáng)度評(píng)分與CD44V4 一致；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分；10%～50%為1 分；>50%～75%為2 分；＞75%為3分。兩項(xiàng)相加后0～1 分為陰性，≥2 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，分析兩變量間的相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD44V4 和nm23 在TNBC 和非TNBC 中的表達(dá)情況

研究組70 例癌組織中，CD44V4 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，nm23 的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 CD44V4 和nm23 在TNBC和非TNBC中的表達(dá)情況[例（%）]

2.2 TNBC 患者CD44V4 和nm23 陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TNBC 癌組織中CD44V4 陽(yáng)性表達(dá)與脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與患者年齡、原發(fā)瘤大小、TNM 分期、病理組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)（P ＞0.05）；nm23陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與其他病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 CD44V4 與nm23 表達(dá)的相關(guān)性

秩相關(guān)性檢驗(yàn)顯示CD44V4 和nm23 之間無(wú)明顯相關(guān)性（rs=-0.166，P ＞0.05）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因[10]。轉(zhuǎn)移的發(fā)生需要腫瘤細(xì)胞成功地完成轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的每一步，包括從原發(fā)腫瘤脫離、向局部組織遷移和侵襲、在循環(huán)和淋巴系統(tǒng)中存活，最終在人體的遠(yuǎn)處器官上定植。TNBC 是乳腺癌分子分型中預(yù)后最差的一型，由不同基因表達(dá)譜組成，雖然各亞組間預(yù)后存在較大差異，但其無(wú)病生存和總體生存仍較差，是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-12]。為此，研究者們都在嘗試尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物，用以鑒別預(yù)后更差的TNBC 患者，并作為臨床治療的靶點(diǎn)。

表2 TNBC 患者臨床病理參數(shù)與CD44V4 和nm23 陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系[例（%）]

本研究對(duì)CD44V4 在TNBC 和非TNBC 中的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示：CD44V4 在TNBC 中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于非TNBC，且其在TNBC 中的表達(dá)與脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這說(shuō)明CD44V4 可能參與了TNBC 的惡性進(jìn)展，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲性。CD44V4 是細(xì)胞黏附因子CD44 變異體的一員，是參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因子[3-4,13]，在乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中也起著重要作用[14]?；A(chǔ)研究證實(shí)，腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵步驟就是脫落的腫瘤細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)而遷移，在這個(gè)過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素起著舉足輕重的作用[15]，而CD44V4 則是介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要的E-選擇素配體[16]。乳腺癌脫落細(xì)胞上的E-選擇素配體CD44V4 與血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的E 選擇素結(jié)合，介導(dǎo)黏附過(guò)程[14]，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶向遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移過(guò)程。

本研究對(duì)TNBC 和非TNBC 中nm23 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在TNBC 組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于非TNBC 組，在TNBC 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度明顯高于腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。這與Iqbal 等[17]的基礎(chǔ)研究和Han等[6]的循證分析結(jié)果一致，說(shuō)明nm23 基因的表達(dá)與乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能呈相關(guān)性，其下調(diào)可觸發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程。nm23 家族是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前認(rèn)為其主要通過(guò)3 個(gè)方面調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移：①通過(guò)與多種基因相互作用調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程；②參與信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移；③通過(guò)影響細(xì)胞遷徙運(yùn)動(dòng)而調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移[18-20]。雖然有學(xué)者認(rèn)為nm23 編碼的部分蛋白在某些腫瘤中具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用[17]，但與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的觀點(diǎn)卻是一致的。

在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一病理參數(shù)研究中，本研究對(duì)CD44V4 過(guò)表達(dá)和nm23 低表達(dá)是否有關(guān)聯(lián)進(jìn)行了相關(guān)性檢測(cè)，以期待其聯(lián)合檢測(cè)能否增加對(duì)預(yù)后的判斷，但相關(guān)性分析顯示兩者表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。原因可能為：①CD44V4 介導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移是通過(guò)選擇素家族血管內(nèi)皮E 選擇素實(shí)現(xiàn)，而nm23 對(duì)轉(zhuǎn)移的調(diào)控是與其他種類(lèi)的黏附因子聯(lián)合完成，兩者之間確實(shí)沒(méi)有相關(guān)性；②選取的TNBC 患者未按基因表型進(jìn)一步分亞型研究，使結(jié)果出現(xiàn)偏差，未能找到兩者的關(guān)聯(lián)。因此本研究的實(shí)驗(yàn)分析并不能完全認(rèn)定CD44V4 與nm23無(wú)關(guān)聯(lián)性，還需要做更多的深入研究。

綜上所述，檢測(cè)CD44V4 和nm23 在TNBC 中的表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)系有重要價(jià)值，可能成為判斷TNBC 預(yù)后的新生物標(biāo)志物。