肖寧，羅慶華，羅濤，魏芳，曾亞軍

(1.貴陽護理職業(yè)學院，貴陽550081；2.貴州師范大學生命科學學院，貴陽550001； 3.荔波縣世界自然遺產管理局，貴州荔波558400；4.貴州省林業(yè)科學研究院，貴陽550004)

徂徠林蛙Ranaculaiensis隸屬于蛙科Ranidae蛙屬Rana，是Li等(2008)依據山東泰安徂徠山的標本而描述，目前已知分布于山東、河南、湖南和廣西等地(費梁等，2012；AmphibiaWeb，2019；Frost，2019；中國兩棲類，2019)。楊寶田等(2013)依據線粒體16S rRNA支持徂徠林蛙的有效性，并認為其與鎮(zhèn)海林蛙Ranazhenhaiensis為姐妹種，兩者處于物種分化過程中的并系階段，其物種分化還未完成。大多數研究均支持該物種的有效性(Yanetal.，2011；楊寶田等，2013；Yuanetal.，2016；Wangetal.，2017；Zhaoetal.，2017)。貴州省現記錄分布的蛙屬物種有威寧蛙R.weiningensis、昭覺林蛙R.chaochiaoensis、峨眉林蛙R.omeimontis、寒露林蛙R.hanluica和鎮(zhèn)海林蛙R.zhenhaiensis5種(伍律等，1986；費梁等，2009；張雷等，2010；陳繼軍等，2017)。魏剛等(2017)基于分子形態(tài)數據將貴州梵凈山地區(qū)的林蛙種類記錄為鎮(zhèn)海林蛙(樣本號：lshz40)和寒露林蛙(樣本號：lshz41)，但是梵凈山種群(樣本號：lshz40)與徂徠林蛙模式產地種群(山東徂徠，標本號：SYNU07050129，GenBank登錄號：KF204620)的遺傳距離為0。

2018年5月在貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)進行本底資源調查時采集到林蛙標本10號，經過形態(tài)學比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為徂徠林蛙，為貴州省新記錄。本研究對徂徠林蛙貴州種群進行了詳細的形態(tài)學描述，補充了其分子遺傳學數據，并與長肢林蛙R.longicrus種組物種進行了系統(tǒng)發(fā)生關系分析，探討它們之間的遺傳分化和系統(tǒng)演化關系。

1 材料與方法

1.1 材料

徂徠林蛙成體標本10號(4雄6雌)，采自貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)(107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m；圖1)。取腿部肌肉保存于90%乙醇中；使用10%福爾馬林浸泡標本，保存于貴州師范大學生命科學學院動物生態(tài)學標本室(GZNU)。

圖1 徂徠林蛙采樣點Fig.1 Sampling points of Rana culaiensis

1.2 形態(tài)學數據測量

測量標準依據費梁等(2009)，使用游標卡尺(Serial No.14133868，德國)測量標本的12個形態(tài)特征(精確度為0.01 mm)，包括頭體長(SVL)、頭長(HL)、頭寬(HW)、吻長(SL)、眼徑(ED)、鼻間距(INS)、眼間距(IOS)、前臂及手長(LAHL)、手長(HL)、后肢全長(HLL)、脛長(TL)和足長(FL)。

1.3 DNA提取、擴增和測序

總DNA提取自保存于90%乙醇中的標本腿部肌肉，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN Catalog 69504)進行提取。選擇線粒體基因16SrRNA、cytb和ND2作為分子標記，擴增引物和反應體系參考Yuan等(2016)進行PCR擴增。擴增產物由成都擎科梓熙生物技術有限公司雙向測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇長肢林蛙種組9個物種的16SrRNA、cytb和ND2基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)，以威寧蛙、中國林蛙R.chensinensis為外群，分子數據主要來自于Yuan等(2016)。使用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)中MUSCLE進行多重序列比對，并使用DAMBE(Xia &Xie，2001)進行序列飽和性檢測。

使用貝葉斯(BI)法和最大似然(ML)法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。最適模型基于赤池信息準則(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)中進行選擇。在MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)中進行BI分析，設置4條鏈獨立運行107代，每隔100代對樹進行1次采樣，前25%被舍棄，使用貝葉斯后驗概率(BPP)來檢測節(jié)點的支持率。在Tracer 1.6(Rambautetal.，2013)中查看相關運行參數的收斂性和有效樣本量(ESS)。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中運行1 000次Bootstrap重復抽樣分析，以檢驗各節(jié)點置信度，使用自舉支持值(BSP)檢驗節(jié)點處的支持率。在MEGA 7.0中以物種為組，采用分組的方法計算了長肢林蛙種組物種間的遺傳距離。

2 結果

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

將采自貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)的4號林蛙標本的16SrRNA、cytb和ND2基因序列上傳到GenBank，標本編號對應的檢索號見表1。對長肢林蛙種組9個物種共計26個標本的16SrRNA、cytb和ND2基因序列進行多重序列比對拼接后的堿基長度為2 336 bp?；谑褂?個線粒體基因聯合序列計算的長肢林蛙種組物種間的遺傳距離為0.77%～2.58%；采自朱家山縣級自然保護區(qū)的徂徠林蛙與該物種模式產地種群之間的遺傳距離為0.77%。

表1 由GenBank中下載用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關序列Table 1 Information of gene sequences used for building phylogenetic trees

注：*Yuan等(2016)將此標本錯錄入為四川威寧，現修訂為貴州威寧
Note：*Yuanetal.(2016)recorded "Sichuan：Weining" as the sampling site，it is now revised as "Guizhou：Weining"

基于BI法和ML法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹生成了相同的的拓撲結構(圖2)，僅在末端分支節(jié)點上存在一些差異。本研究樣本與模式產地的徂徠林蛙聚為一支(BPP=0.99，BSP=91)，與鎮(zhèn)海林蛙為姐妹種，這與之前的研究有著相似的樹形結構(Yanetal.，2011；楊寶田等，2013；Yuanetal.，2016；Wangetal.，2017)。因此，基于系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳距離的結果表明，本次采集的林蛙物種為徂徠林蛙。

2.2 形態(tài)描述

雄性頭體長41.61～51.09 mm，雌性頭體長48.46～56.60 mm(表2)；頭長大于頭寬(雄)，頭長略小于頭寬(雌)；吻端略鈍圓，突出于下唇；吻棱清晰；鼻孔位于吻棱下方，在眼和吻端之間；眼間距略等于鼻間距；瞳孔呈橫橢圓形；顳褶弱；鼓膜近圓形，約為眼徑的2/3；犁骨齒列呈兩短斜行；舌卵圓形，其后端缺刻深。

圖2 基于線粒體聯合序列構建的長肢林蛙種組物種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Rana longicrus species group constructed using mitochondrial joint sequence紅色部分表示來自貴州省黃平縣的徂徠林蛙樣品Red indicates the R.culaiensis samples were from Huangping county，Guizhou province

四肢較為細長，前臂及手長為頭體長的59.29%；指細長，末端鈍圓；指側具較細的緣膜；第二指與第四指約等長；指長順序為Ⅲ>Ⅱ≈Ⅳ>Ⅰ；關節(jié)下瘤發(fā)達，內掌突較大呈卵圓形；后肢全長為體全長的189.76%；前伸貼體時脛跗關節(jié)超過眼前角；左右跟部略重疊；脛長為頭體長的60.32%；脛長略大于足長；趾細長，趾端略膨大呈圓形而無溝；關節(jié)下瘤大而明顯；第三趾長于第五趾，第三趾超過第四趾第二關節(jié)下瘤，第五趾達第二關節(jié)下瘤，趾長順序為Ⅳ>Ⅲ>Ⅴ>Ⅱ>Ⅰ；趾間蹼較發(fā)達；雌蛙趾間蹼均不達趾端，第四趾兩側蹼其凹陷處位于第四趾第一關節(jié)與第二關節(jié)約 1/2處，兩側蹼以緣膜達第二關節(jié)下瘤；內蹠突呈橢圓形、明顯，外蹠突不顯著(圖3)。

生活史顏色變異較大，為棕色或橄欖棕色，雌蛙多棕色；皮膚較光滑，背部及體側有少數小圓疣；體腹面光滑；體背面多為紅褐色或棕灰色而無深色斑，背側褶細窄從眼后上方直達胯部，在顳部上方略向外側彎曲，不與顳褶相連；頷腺細窄從口角延續(xù)至肩部上方；顳部有黑色三角斑，眼間有深色橫斑或橫斑顏色淺；兩眼間的橫斑、顳部的三角形斑以及背部的“八”形斑或短桿狀斑均為黑褐色，個別個體體側有褐色斑或小點；四肢背面黑褐色橫紋，較為細窄長，排列較為緊密，前臂有2～3條，股部有4～7條；脛部有5～6條；腹面乳黃色(圖3)。

第二性征：雄性無聲囊；雄性第一指具大而密的婚刺。

2.3 生境描述

貴州朱家山縣級自然保護區(qū)位于107°35′～107°42′E，26°53′～27°06′N，為武陵山脈向西南的延伸部分，是舞陽河主流和清水江支流的主要發(fā)源地。該區(qū)具明顯的亞熱帶季風氣候特征。采自朱家山縣級自然保護區(qū)的徂徠林蛙生境較多樣，包括農田和山間較濕潤的林區(qū)。5月調查時已發(fā)現其幼體完全變態(tài)營陸地生活，因此推測該蛙的繁殖時間為3—4月，這與Li等(2008)記錄的一致。

3 討論

本研究結合形態(tài)學數據和3個線粒體基因從分子生物學的角度證實貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)分布林蛙為徂徠林蛙。從貴州黃平和山東徂徠山采集的徂徠林蛙在繁殖時間(Lietal.，2008)和遺傳上的差異較小(表3)，兩地種群遺傳距離為0.77%，小于徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙之間的遺傳距離(1.80%)，因此本研究采納了楊寶田等(2013)的觀點，將貴州黃平分布的林蛙記錄為徂徠林蛙。但貴州黃平和山東徂徠山的樣本在身體各部位的形態(tài)性狀和量度上仍存在一定的差異：1)前者的第四趾兩側蹼凹陷處位于第四趾第一關節(jié)與第二關約1/2處；而后者的趾間蹼缺刻深，其凹陷處位于第四趾第二關節(jié)處；2)前者眼間有深色橫斑或色斑顏色較淺，背面有倒“V”形斑；而后者眼間無深色橫斑，無倒“V”形斑；3)在前臂及手長占頭體長的比例上，前者(雌性為64.07%，雄性為59.29%)大于后者(雌性為45.54%，雄性為44.26%)；4)在體型上，前者(平均值：雄性44.73 mm，雌性52.29 mm)小于后者(平均值：雄性53.57 mm，雌性62.04 mm)。由于本研究采集的徂徠林蛙標本數量有限，上述差異是否為適應不同的地理環(huán)境而導致的形態(tài)變異，還有待采集符合統(tǒng)計學的標本數據來論證。

表2 貴州黃平朱家山縣級自然保護區(qū)徂徠林蛙的量度Table 2 Morphological measure of Rana culaiensis in the Zhujiashan Nature Reserve，Huangping，Guizhou

圖3 貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)分布的徂徠林蛙生態(tài)照Fig.3 Ecological images of Rana culaiensis distributed in the Zhujiashan Nature Reserve，Huangping county，Guizhou provinceA.背面觀，B.腹面觀，C.側面觀，D.手腹面觀，E.足腹面觀，F.頭部側面觀A.dorsal view，B.ventral view，C.side view，D.ventral view of hand，E.ventral view of foot，F.side view of head

表3 基于線粒體聯合序列計算的長肢林蛙種組物種間的遺傳距離(P-distance，%)Table 3 Genetic distances among the species of Rana longicrus species group based on mitochondrial joint sequences (P-distance，%)

貴州地區(qū)最早分布的林蛙記錄為日本林蛙指名亞種R.japonicajaponica和日本林蛙昭覺亞種R.japonicachaochiaoensis，后修訂為峨眉林蛙和昭覺林蛙(Liuetal.，1946；費梁等，1990；葉昌媛等，1993)。

這2種林蛙曾被作為廣泛種記錄在貴州省的各個區(qū)縣(伍律等，1986；貴州省黔東南苗族侗族自治州人民政府，1989；喻理飛，2004；貴州省林業(yè)廳，2006；費梁等，2009；貴州省林業(yè)科學研究院，貴州省盤縣林業(yè)局，2013；茍光前等，2017)。但近年來貴州省東部地區(qū)的蛙屬物種分布尚存爭議(張雷等，2010；陳繼軍等，2017)。魏剛等(2017)對梵凈山地區(qū)的蛙屬進行了調查和研究，基于線粒體16SrRNA的分析表明，該地區(qū)分布有鎮(zhèn)海林蛙和寒露林蛙，而未發(fā)現所記錄的日本林蛙指名亞種(貴州省林業(yè)廳，梵凈山國家級自然保護區(qū)，1990)，即峨眉林蛙。然而，在魏剛等(2017)基于線粒體16SrRNA的研究中，其鎮(zhèn)海林蛙樣本(樣本號：lshz40)與來自模式產地的徂徠林蛙的遺傳距離為0，加上黃平朱家山與梵凈山地區(qū)同屬于武陵山系，對物種的阻隔較小(Zhanetal.，2009)，因此，魏剛等(2017)記錄于梵凈山地區(qū)分布的鎮(zhèn)海林蛙與朱家山地區(qū)分布的林蛙應為同一物種，是徂徠林蛙的錯誤鑒定。截止目前，貴州地區(qū)是否分布有峨眉林蛙，尚有待進一步調查。

蛙屬物種的形態(tài)保守性成為依靠形態(tài)特征鑒別的困難，因此在今后有必要結合分子生物學開展系統(tǒng)地理學和分類學研究。貴州作為第一階梯和第二階梯的過渡區(qū)域，已有越來越多的研究證明了該地區(qū)是一些生物的起源和擴散的中心(Yanetal.，2013；Yuanetal.，2016；姚明燦等，2018)。因此，對于在青藏高原以外的地區(qū)進行相關的生物地理學研究和厘清貴州高原地區(qū)的物種組成，以期進一步理解高原運動對物種形成和對保護物種多樣性作出科學的保護決策有著重要的作用。

致謝：感謝貴州省林業(yè)科學研究院、黃平縣朱家山縣級自然保護區(qū)工作人員在調查過程中提供的幫助。