劉雅慧，袁文峰，王志娟，張 慶，白 樺，呂 慶

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，工業(yè)與消費品安全研究所，北京 100176)

N-亞硝胺是一類具有—N—N=O結(jié)構(gòu)的有機(jī)污染物，在人們研究的300多種N-亞硝胺中，90%以上對動物具有致癌作用[1]。國際癌癥研究署(IARC)將N-亞硝基二甲胺(NDMA)和N-亞硝基二乙胺(NDEA)列為2A類致癌物，將N-亞硝基二丙胺(NDPA)、N-亞硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基吡咯(NPYR)、N-亞硝基哌啶(NPIP)和N-亞硝基二丁胺(NDBA)列為2B類致癌物[2]。N-亞硝胺的前體物是指在一定條件下能夠生成N-亞硝胺的物質(zhì)，包括亞硝酸鹽、仲胺和氮氧化合物[3]，這些前體物可被用作橡膠和塑料的強(qiáng)度和彈性添加劑[4]。歐盟玩具安全標(biāo)準(zhǔn)EN 71—12:2016[5]規(guī)定：供36個月以下兒童使用的擬打算或可能放入口中使用的玩具中N-亞硝胺遷移量≤0.01 mg/kg，N-亞硝胺前體物遷移量≤0.1 mg/kg；其余玩具(除指畫顏料中N-亞硝胺遷移量≤0.02 mg/kg外)中N-亞硝胺遷移量≤0.05 mg/kg，N-亞硝胺前體物遷移量≤1.0 mg/kg。美國華盛頓州兒童高關(guān)注化學(xué)品清單(CHCC)中規(guī)定了NDMA的限量為1.0 mg/kg[6]。

N-亞硝胺在食品、飲用水、化妝品中的檢測報道較多[7-9]。在兒童用品方面，研究者更多關(guān)注于奶嘴、氣球等彈性體，塑料玩具中N-亞硝胺的檢測方法則少有報道，已報道的方法多是研究N-亞硝胺遷移量。例如，Altkofer等[10]采用氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)測定氣球中8種N-亞硝胺遷移量；Anna等[4]采用氣相色譜-超聲分子束電子電離質(zhì)譜法測定奶嘴中14種N-亞硝胺遷移量；Sung等[11]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶嘴中8種N-亞硝胺遷移量；黃理納等[12]采用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法測定與口接觸玩具及兒童用品中14種可遷移N-亞硝胺及其前體物。目前尚未見玩具中N-亞硝胺殘留量測定方法的報道。

塑料是兒童玩具使用最廣泛的材料，其中以丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)和聚氯乙烯(PVC)材質(zhì)最為常見。對于塑料樣品來說，采用常規(guī)的頂空、熱解吸等方法通常僅能測定物質(zhì)的揮發(fā)量；針對殘留量測定常見的方法有超聲提取、微波萃取、索式提取、加速溶劑萃取等，其中，超聲提取和微波萃取難以保證提取率，索氏提取耗時較長且消耗大量有機(jī)溶劑，加速溶劑萃取在優(yōu)化條件下的溶劑消耗少且能夠?qū)崿F(xiàn)較高的提取率，然而在高溫高壓下，塑料樣品可能會發(fā)生溶解或膨脹，導(dǎo)致管道堵塞等問題。Garrigós等[13]、Al-Natsheh等[14]、吳莉莉等[15]對比了多種提取方法對塑料樣品中目標(biāo)物的提取效果，結(jié)果表明，溶解-沉淀法的提取率最優(yōu)，且操作簡便、污染小、成本低。塑料樣品經(jīng)溶解-沉淀后，基質(zhì)提取液的色素等雜質(zhì)較多，需經(jīng)固相萃取凈化以減少基質(zhì)干擾，同時保護(hù)儀器。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)的選擇性及靈敏度較高，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，與溶解-沉淀法結(jié)合可以省去凈化過程，實現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測。

本研究擬采用溶解-沉淀法結(jié)合GC-MS/MS測定塑料兒童玩具中15種N-亞硝胺的殘留量?？疾旆椒ǖ倪x擇性、溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)，以及自制陽性樣品溶解-沉淀法的提取率，并將該方法應(yīng)用于實際玩具樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ 8000 Evo氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；SPEX 6875液氮冷凍研磨機(jī)：美國SPEX Sample Prep公司產(chǎn)品；P300H超聲清洗機(jī)：德國Elma公司產(chǎn)品；CR 21N型高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi公司產(chǎn)品。

15種N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于95%，分別購自日本TCI公司、德國Dr. Ehrenstorfer公司和美國Sigma公司；甲醇、丙酮：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；四氫呋喃：色譜純，韓國Duksan公司產(chǎn)品；尼龍66濾膜(0.22 μm)：天津津騰公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取各50 mg物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成1 000 mg/L的單標(biāo)儲備液。移取適量的單標(biāo)儲備液，分別以甲醇、甲醇-丙酮(7∶3,V/V)和甲醇-四氫呋喃(7∶3,V/V)為溶劑，配制成3種10 mg/L混標(biāo)儲備液，4 ℃避光保存。使用時根據(jù)需要稀釋至相應(yīng)濃度的混合工作溶液。

空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：空白塑料樣品按1.3節(jié)步驟處理后，得到空白基質(zhì)提取液，根據(jù)需要將混標(biāo)儲備液稀釋成空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

此外，分別以丙酮、四氫呋喃為溶劑配制50 mg/L的N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于ABS和PVC塑料陽性樣品的制備。

1.3 樣品前處理

將玩具樣品液氮冷凍粉碎至粒徑小于1 mm，稱取0.1 g樣品于10 mL具塞玻璃瓶中，加入3 mL溶劑(向ABS樣品中加入丙酮，向PVC樣品中加入四氫呋喃)后，超聲2 min，使樣品充分溶解，然后緩慢加入7 mL甲醇，使塑料基質(zhì)完全沉淀，在4 ℃下，以13 000 r/min離心5 min，取上層清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)測定。

1.4 陽性樣品制備

ABS陽性樣品：稱取5 g空白樣品至三角瓶中，先加入15 mL丙酮，再加入2 mL 50 mg/L的15種N-亞硝胺的丙酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不斷攪拌，然后加入3 mL丙酮，繼續(xù)攪拌至塑料樣品恰好完全溶解，混合均勻，將溶液平鋪在大表面皿中，置于通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干，得到N-亞硝胺含量為20 mg/kg的ABS陽性樣品。

PVC陽性樣品：以四氫呋喃代替丙酮，以四氫呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)溶液代替丙酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余同ABS陽性樣品。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 DB-17MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(≥99.999%)，載氣流速1.0 mL/min；脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力200 kPa，脈沖時間1 min；進(jìn)樣體積1 μL；進(jìn)樣口溫度270 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至150 ℃，然后以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.5.2質(zhì)譜條件 EI電離源；電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃，傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲3 min；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

已報道的用于N-亞硝胺分離的色譜柱主要有弱極性的HP-5MS[16]，中等極性的DB-35MS[17]、DB-624[1]、DB-1701[18]，以及強(qiáng)極性的DB-WAX[19]。本研究考察了中等極性且具有較高熱穩(wěn)定性的DB-17MS色譜柱，結(jié)果表明，15種N-亞硝胺色譜峰的峰型尖銳對稱，且大多基線分離，對于個別共流出色譜峰(如9/10)能夠通過提取特征離子對對其進(jìn)行有效分離，且不影響定性和定量分析。

對15種N-亞硝胺進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，選取2～3個特征離子作為母離子，分別在10、20、30 eV的碰撞能量下進(jìn)行子離子掃描，選擇碎片強(qiáng)度較大的二級碎片離子研究最佳碰撞能量，利用儀器的自動優(yōu)化SRM離子對(Auto SRM)輔助功能最終確定了定量和定性離子對以及最優(yōu)碰撞能量。15種N-亞硝胺的色譜、質(zhì)譜參數(shù)列于表1，典型的SRM色譜圖示于圖1。

注：各物質(zhì)編號與表1中一致圖1 15種N-亞硝胺的典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogramof 15 kinds of N-nitrosamines

2.2 方法的選擇性考察

塑料樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，經(jīng)過溶解-沉淀提取后，采用C18[20]、石墨化碳[11]等SPE柱進(jìn)行凈化，增加了前處理步驟以及檢測成本；也有不 經(jīng)凈化直接進(jìn)樣的報道[14,21]，本研究將對此進(jìn)行考察。在全掃描模式下，ABS塑料樣品提取液的色譜圖有較多雜峰且響應(yīng)強(qiáng)度較大，示于圖2a；同一提取液在串聯(lián)質(zhì)譜的SRM模式下，背景較為干凈，雜質(zhì)峰并未對N-亞硝胺的檢測產(chǎn)生干擾，示于圖2b。此外，在經(jīng)過200次以上進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，僅有極少量的色素等雜質(zhì)殘留在襯管中，可能是由于該類色素沸點較高，滯留于襯管且未發(fā)生分解，但未對檢測產(chǎn)生明顯影響。在SRM掃描模式下，所有待測物質(zhì)均在20 min以內(nèi)出峰，20.2 min以后質(zhì)譜燈絲關(guān)閉，故在20.2 min之后出現(xiàn)的雜質(zhì)峰不會影響燈絲的使用壽命。GC-MS/MS具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)背景干擾能力，省去了基質(zhì)凈化過程，從而使該方法更加簡便、快速、節(jié)約成本。

2.3 溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)

本實驗進(jìn)一步考察了溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)對N-亞硝胺檢測結(jié)果的影響。分別對甲醇、甲醇-丙酮(7∶3，V/V)混合溶劑、甲醇-四氫呋喃(7∶3，V/V)混合溶劑、3種ABS空白基質(zhì)提取液和3種PVC空白基質(zhì)提取液配制的濃度均為50 μg/L的15種N-亞硝胺混標(biāo)在同一條件下進(jìn)行測定，重復(fù)6次，對比目標(biāo)物質(zhì)在相同濃度下的響應(yīng)值，選取具有代表性的7種物質(zhì)進(jìn)行繪圖，結(jié)果示于圖3?？梢?，采用甲醇-丙酮混合溶劑與純甲醇溶劑的響應(yīng)較為接近，少數(shù)物質(zhì)(如NMPhA、NDBA)略低于甲醇溶劑。采用 甲醇-四氫呋喃混合溶劑對NMPhA、NEPhA具有明顯的抑制效應(yīng)，而對于NMEA、NMOR和NDBA具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，表明四氫呋喃溶劑對N-亞硝胺檢測的影響較為顯著。

圖2 在全掃描模式下，ABS玩具樣品的色譜圖(a)和SRM模式下同一樣品的色譜圖(b)Fig.2 Chromatograms of an ABS sample under the full scan mode (a) and the same sample under the SRM mode (b)

圖3 溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)對N-亞硝胺響應(yīng)值的影響(n=6)Fig.3 Effect of solvent effect and matrix effect on the peak area of N-nitrosamines (n=6)

采用空白基質(zhì)提取液配制的混標(biāo)對N-亞硝胺具有不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制作用，如NDMA、NMOR和NDBA等物質(zhì)，兩種塑料基質(zhì)對其均具有一定的增強(qiáng)作用；對于NEPhA，PVC基質(zhì)配制的混標(biāo)對其影響不大，但ABS基質(zhì)配制的混標(biāo)對其產(chǎn)生增強(qiáng)作用。從3個相同材質(zhì)樣品的結(jié)果來看，盡管存在基質(zhì)效應(yīng)，但相同的ABS基質(zhì)之間，或者PVC基質(zhì)之間差別不大。因此在實際樣品檢測中，采用空白基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 方法提取率的考察

采用溶解-沉淀法對塑料樣品中的N-亞硝胺進(jìn)行提取，并考察該方法的提取率。由于無法買到具有特定含量的N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，本實驗室自制了20 mg/kg陽性樣品，按1.3節(jié)方法處理，然后進(jìn)行回收率測定。經(jīng)溶解-沉淀法提取ABS陽性樣品的回收率在66.8%～106.4%之間，示于圖4。關(guān)于沸點較低的物質(zhì)(如NDMA、NMEA等)回收率較低，可能是這兩種物質(zhì)在室溫下的揮發(fā)性較強(qiáng)，在陽性樣品制備過程中損失較多，導(dǎo)致回收率偏低，而溶解-沉淀法本身具有較高的絕對提取率。對于PVC陽性樣品，多數(shù)物質(zhì)的回收率在90.0%～110.0%之間，而NDMA、NMEA和NDEA的回收率低于65.0%，可能是由于四氫呋喃的揮發(fā)性較丙酮差，在制作PVC陽性樣品時，自然風(fēng)干時間更長，造成這3種物質(zhì)在制作過程中的損失增多。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限 分別以ABS和PVC的空白基質(zhì)提取液配制一系列濃度為0.02～20 mg/kg的15種N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度從低到高依次測定，以10倍信噪比計算得到各物質(zhì)的定量限分別為0.02～0.1 mg/kg(ABS)和0.02～0.2 mg/kg(PVC)。以定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)，各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，在0.02～20 mg/kg線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.996 3，結(jié)果列于表1。

2.5.2回收率與精密度 在ABS和PVC空白玩具提取液中對每種N-亞硝胺設(shè)定3個不同添加水平，分別為10 mg/kg、1 mg/kg和定量限附近。對每個添加水平重復(fù)6次實驗，結(jié)果列于表2?？芍?5種物質(zhì)在ABS樣品中的回收率為77.6%～126.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～8.7%；在PVC樣品中的回收率為75.6%～122.4%，RSD為1.4%～10.2%。

注：橫坐標(biāo)物質(zhì)編號與表1中一致圖4 溶解-沉淀法提取陽性樣品中15種亞硝胺的回收率Fig.4 Recoveries of 15 N-nitrosamines in positive samples using dissolution-precipitation method

2.6 實際樣品分析

從商場和電商平臺上隨機(jī)采購了35個ABS和30個PVC塑料玩具，應(yīng)用本方法進(jìn)行檢測，均未檢出15種N-亞硝胺。由此可初步判斷目前我國市場上的塑料玩具中N-亞硝胺的存在情況較為安全。

3 結(jié)論

基于溶解沉淀-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了塑料玩具中15種N-亞硝胺殘留量的測定方法。該方法具有較強(qiáng)的選擇性，且對于塑料樣品中的目標(biāo)物質(zhì)具有較高的提取率。由于存在溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)，需要采用空白基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏且成本較低，適用于塑料玩具中N-亞硝胺殘留量的測定，也可為塑料樣品中其它物質(zhì)的殘留量測定提供借鑒。