陳舒穎 廖明 楊麗娜

【摘要】 目的 探討TET1蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453增殖的影響。方法 將TET1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（MDA-MB-453-TET1）和其陰性對(duì)照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（MDA-MB-453-NC）通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建出來(lái)， 采用RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)TET1的表達(dá)情況。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）檢測(cè)細(xì)胞增殖;Western blot檢測(cè)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白[上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-鏈蛋白（β-catenin）]的呈現(xiàn)。結(jié)果 陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表達(dá)水平比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組E-cadherin（2.98±0.11）、TET1 mRNA（5.36±0.02）及TET1（12.3±0.41）均顯著高于陰性對(duì)照組的（0.98±0.21）、（1.25±0.08）、（4.21±0.09）與空白對(duì)照組的（0.95±0.2）、（1.23±0.04）、（4.19±0.10）， N-cadherin（0.08±0.02）、Vimentin（4.41±0.18）、β-catenin（0.05±0.002）均低于陰性對(duì)照組的（0.10±0.01）、（9.98±0.52）、（0.11±0.02）與空白對(duì)照組的（0.11±0.02）、（9.97±0.45）、（1.23±0.04）， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組OD值比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組OD值低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TET1可抑制MDA-MB-453細(xì)胞增殖， 其機(jī)制可能與通過(guò)Wnt/β-catenin通路抑制EMT的發(fā)生相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;細(xì)胞株MDA-MB-453;TET1蛋白;細(xì)胞增殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.113

TET蛋白是存在于生物體內(nèi)的一種雙加氧酶， 其不但能使5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶， 同時(shí)還是DNA去甲基化過(guò)程中必不可少的一種酶， 這種酶在保持干細(xì)胞的多能性時(shí)也有著相當(dāng)重要的用處[1]。該家族主要包括3種蛋白酶， 即TET1、TET2和TET3， 其中TET1蛋白參與腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[2]。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究TET1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響， 為研究乳腺癌的發(fā)生提供一定的參考。

1 材料與方法

1. 1 試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453與人胚腎HEK 293T慢病毒包裝細(xì)胞（深圳市百恩維生物科技有限公司提供）;DMEM培養(yǎng)液（武漢普諾賽生命科技有限公司提供）;胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司提供）;Ⅱ型膠原酶（上海玉博生物科技有限公司提供）;胰蛋白酶及基質(zhì)膠與Mdivi-1（上海玉博生物科技有限公司提供）;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin一抗、羊抗兔熒光二抗、羊抗鼠熒光二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1. 2 方法 根據(jù)慢病毒的包裝試劑外殼的使用說(shuō)明來(lái)操作， 把轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞培育72 h， 然后將培育中的清液收集起來(lái)， 即是慢病毒液。然后把感染靶細(xì)胞（MDA-MB-453）用嘌呤霉素做一次詳細(xì)的挑選， 從中取得MDA-MB-453-TET1組和陰性對(duì)照組（MDA-MB-453-NC）;最后用未感染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。三組分別選取2×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析， 對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。

按照TET1試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。制備電泳膠， 將電泳膠放入電泳槽， 在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）熱循環(huán)儀中將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參， 上游5'-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3'， 下游5'-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3';TET1上游5'-GTGTGATGAGCCCAAGGA-3'， 下游5'-GCAGTTGGCTCGCATCATAG-3'。PCR反應(yīng)條件：在95℃10 min， 95℃50 s， 52℃50 s， 72℃3 min， 重復(fù)37個(gè)循環(huán)， 72℃延伸反應(yīng)20 min， 計(jì)算TET1信使RNA（mRNA）水平相對(duì)表達(dá)量。

提取細(xì)胞總蛋白， 然后作十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）， 再轉(zhuǎn)膜， 在其中添加對(duì)應(yīng)一抗， 以4℃的溫度放置一晚。第2天進(jìn)行含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）漂洗， 加入二抗， 室溫孵育2 h， 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色， 計(jì)算蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 按1×103個(gè)細(xì)胞的量加入到96孔板里面， 放入CCK-8后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)， 時(shí)間的設(shè)定為0、12、24、36和72 h， 根據(jù)時(shí)間長(zhǎng)短的排序依次放入CCK-8試劑10 μl/孔， 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng);酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔450 nm處的光密度（OD）值。這一實(shí)驗(yàn)過(guò)程最少要進(jìn)行3次以上， 然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和研究。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較三組RT-PCR及Western blot法檢測(cè)結(jié)果以及細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所獲數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布規(guī)律， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組RT-PCR及Western blot法檢測(cè)結(jié)果比較 陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表達(dá)水平比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組E-cadherin、TET1 mRNA及TET1表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表達(dá)水平均低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 三組細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果比較 陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組OD值比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組OD值低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

研究表明[3]， TET1可以調(diào)控DNA去甲基化， 參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)部位， 經(jīng)過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)移動(dòng)到其他地方。在這個(gè)過(guò)程中， 腫瘤細(xì)胞得到了間質(zhì)細(xì)胞才有的遷徙能力， 這是由于腫瘤細(xì)胞的上皮型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)呈下降趨勢(shì)， 間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的表達(dá)呈上升狀態(tài)而導(dǎo)致的。大量研究表明， E-cadherin的啟動(dòng)子區(qū)域有超甲基化這一現(xiàn)象， 這也被視作是引起E-cadherin表達(dá)呈下降趨勢(shì)的一大主要影響因素。TET1經(jīng)過(guò)調(diào)整EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響乳腺癌的侵襲和移動(dòng)[4-6]。

本研究中TET1在MDA-MB-453-TET1組出現(xiàn)高表達(dá)， 陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組出現(xiàn)低表達(dá)， 說(shuō)明MDA-MB-453-TET1的構(gòu)建比較成功。MDA-MB-453-TET1細(xì)胞中E-cadherin表現(xiàn)是一種高表達(dá)， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表現(xiàn)是一種低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明， TET1能經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)EMT影響乳腺癌的侵襲和移動(dòng)， 然后經(jīng)過(guò)推進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向上皮樣表型轉(zhuǎn)化， 提高E-cadherin的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附能力， 最終使N-cadherin、Vimentin和β-catenin減少， 從而抑制EMT發(fā)生。CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株增殖能力實(shí)驗(yàn)中， 在接種細(xì)胞24、36、72 h后MDA-MB-453-TET1組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢。說(shuō)明TET1的過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞的增殖。

綜上所述， TET1可抑制MDA-MB-453細(xì)胞增殖， 其機(jī)制可能與通過(guò)EMT相關(guān)蛋白通路抑制EMT的發(fā)生相關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 段紅潔， 張愛(ài)民， 牛秀瓏， 等. IFN-γ和IL-4對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影響及其機(jī)制. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志， 2015， 22（5）：597-602.

[2] Chen HF， Wu KJ. Epigenetics， TET proteins， and hypoxia in epithelial-mesenchymal transition and tumorigenesis. BioMedicine（Taipei）， 2016， 6（1）：1-8.

[3] Huang Y， Chavez L， Chang X， et al. Distinct roles of the methylcytosine oxidases Tet1 and Tet2 in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（4）：1361-1366.

[4] 張萌萌， 李雅琪， 張碩， 等. TET1蛋白對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株增殖和侵襲能力的影響及其相關(guān)機(jī)制. 腫瘤防治研究， 2017， 44（7）：447-453.

[5] Jeschke J， Collignon E， Fuks F. Portraits of TET-mediated DNA hydroxymethylation in cancer. Curr Opin Genet Dev， 2016， 36（36）：16-26.

[6] Yang H， Liu Y， Bai F， et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation. Oncogene， 2013， 32（5）：663-669.

[收稿日期：2019-03-06]