徐小萬，夏碧波,，宮 超，王恒明，李 穎，吳智明

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣州510225）

0 引言

辣椒(Capsicumspp.)在蔬菜作物中地位頗高，享譽(yù)國際，不僅具有世界性的種植范圍，也受到全球消費(fèi)者的喜愛，可謂家庭必備[1]。辣椒屬于茄科(Solanaceae)茄亞族(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)一年生或多年生植物，灌木、半灌木，多分枝。辣椒屬大約有25個(gè)種，國際植物遺傳資源委員會確定其中5個(gè)為栽培種，它們是C.annuum、C.frutescens、C.chinense、C.baccatum、C.pubescens[2]。辣椒主要分布在南美洲，栽培種世界各地均有分布。

世界各國非常重視辣椒育種研究，常規(guī)育種已經(jīng)取得了巨大成就，選育了一大批優(yōu)良品種應(yīng)用于生產(chǎn)，產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。世界各辣椒育種團(tuán)隊(duì)對辣椒種質(zhì)資源開展了大量研究，這些研究成果對辣椒育種和產(chǎn)量的提高起到很重要的作用。盡管各辣椒科研團(tuán)隊(duì)收集引進(jìn)或創(chuàng)制了較豐富的辣椒種質(zhì)資源，但是大部分研究工作都停留在辣椒種質(zhì)資源形態(tài)描述階段[3-4]。分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記之后，近20 年來，廣泛應(yīng)用的一種新的標(biāo)記方法。與以往的遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記有許多特殊的優(yōu)點(diǎn)，如無表型效益、不受環(huán)境限制和影響等。分子標(biāo)記已廣泛用于種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。

利用分子標(biāo)記技術(shù)開展了部分辣椒種質(zhì)資源分析研究工作，如基于DNA 分子雜交的分子標(biāo)記RFLP[5]，基于 PCR 反應(yīng)的分子標(biāo)記 RAPD[6-11]、SSR[12-13]、ISSR[14-17]、SRAP[12-13,18]，基于 PCR 與限制性酶切結(jié)合的檢測方法AFLP[19]。上述利用分子標(biāo)記分析辣椒種質(zhì)資源相關(guān)研究取得了較好成效，但辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析相對滯后于辣椒種質(zhì)資源的開發(fā)與利用。

國外辣椒種質(zhì)與國內(nèi)資源親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，遺傳差異也較大，國外種質(zhì)資源引進(jìn)可拓展中國辣椒遺傳背景，增加資源儲備，為保證國內(nèi)辣椒育種及產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者以國外引進(jìn)的30 份辣椒種質(zhì)為試材[20]，采用ISSR 分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)的聚類分析，為準(zhǔn)確鑒定辣椒種質(zhì)和科學(xué)利用辣椒材料提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30份辣椒種質(zhì)資源均引自馬來西亞，其中編號為156、159、162、163、168、181、182 和198 的8 份材料田間表現(xiàn)抗疫病和青枯病。

1.2 辣椒基因組DNA的提取

參照CTAB法提取30份辣椒材料基因組DNA[17]，試驗(yàn)所用的緩沖液、dNTP 和Taq DNA 聚合酶均購自上海Sangon公司。

1.3 ISSR引物和擴(kuò)增反應(yīng)體系

根據(jù)SSR 序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)的一套固定的ISSR 引物。本研究采用的是加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia Biotechnology, UBC)公布的ISSR引物，共計(jì)96條。從預(yù)備試驗(yàn)中篩選出8條引物，這8條引物能擴(kuò)增出清晰，重復(fù)性、穩(wěn)定性及多態(tài)性均較好的PCR 產(chǎn)物。ISSR-PCR 反應(yīng)體系參照徐小萬等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用ABI377測序儀保存電泳膠圖。利用GENESCAN軟件分析保存的膠圖，每2個(gè)堿基讀一次數(shù)，Marker片段范圍為50～1000 bp，共讀取475 個(gè)數(shù)。一個(gè)泳道為一個(gè)樣品，每個(gè)泳道加入的熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)ROX-1000，50～1000 bp 共23 條帶。利用膠圖中保存的圖像信號直接生成分子量矩陣(Matrix)，而后采用BINTHERE軟件把生成的分子量矩陣轉(zhuǎn)變?yōu)椤?”、“1”二維矩陣，無帶記為“0”，有帶記為“1”[21]。

用NTSYSpc-2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。聚類圖參照下列步驟進(jìn)行：對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣，用SHAN程序中的UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot 模塊生成聚類圖。主坐標(biāo)二維圖或三維圖按照下列步驟進(jìn)行：利用Qualitative Data程序生成30份國外引進(jìn)辣椒種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)矩陣，接著生成Dim center 數(shù)據(jù)矩陣，而后采用Eigen 程序，最后在Mtrix plot 和Mod3D plot選項(xiàng)中生成主坐標(biāo)二維圖和三維圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與ISSR引物分析

采用改良的CTAB法提取辣椒葉片DNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，各DNA 帶型均整齊一致，基本無降解現(xiàn)象。將 30 個(gè)樣的 DNA 濃度均調(diào)整到 40 ng/μL 進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增。從96個(gè)ISSR引物中篩選出的8個(gè)引物，在30 個(gè)辣椒樣品中共產(chǎn)生1781 條帶（表1），多樣性條帶共計(jì)1389 條，多樣性位點(diǎn)百分率77.99%。上述分析說明，試驗(yàn)檢測的樣品具有較高的遺傳多樣性。8 條ISSR 引物的平均多元率(multiplex ration)為222條帶/引物，多樣帶多元率為173條帶/引物。

8 條ISSR 引物在30 個(gè)辣椒樣品中擴(kuò)增片段的大小主要在200～650 bp 之間。但不同的引物能擴(kuò)增出來的條帶數(shù)也是不同的，其中引物編號835和886擴(kuò)增出的條帶數(shù)較多，分別為263 和250 條；而引物編號807 和840 擴(kuò)增出的條帶數(shù)較少，分別為148 和157條。從表1 分析可知，8 條引物在30 份試驗(yàn)樣品間擴(kuò)增出來的條帶的多態(tài)率也是不同的，引物編號807 的條帶多態(tài)率最高為86.54%，而引物編號835 和886 引物的多態(tài)率較低，分別為73.00%和72.40%。由此可見辣椒種質(zhì)資源存在極為豐富的遺傳多樣性，利用分子標(biāo)記可以檢測辣椒種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

圖1 為引物編號807 和808 分別在編號為156、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、177、178、180、181、182、183、184、190、191、192、198和199的30個(gè)辣椒材料中的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖譜。

表1 30份辣椒資源8條ISSR引物PCR擴(kuò)增位點(diǎn)的多樣性

2.2 聚類分析

圖2 表明，30 個(gè)國外引進(jìn)的辣椒資源的遺傳相似性系數(shù)在0.70～0.87 之間。從UPGMA 法聚類分析圖可知（圖2），遺傳相似性系數(shù)在約0.724(L1)時(shí)，30份國外引進(jìn)的辣椒材料分為3個(gè)大類。第1類是最大的一個(gè)類群，共19 份辣椒材料，編號分別是156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173、158 和 191；第 2 類共 10 份辣椒種質(zhì)資源，編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177 和175；第3 類只有編號為167 的辣椒資源。若以遺傳相似性系數(shù)0.771(L2)為界，這30份國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)可分為4亞類。第Ⅰ亞類共18份辣椒材料，編號分別為156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173和158；第Ⅱ亞類只有編號為191 的辣椒種質(zhì)；第Ⅲ亞類編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亞類只有編號為167的辣椒資源。

2.3 辣椒種質(zhì)資源親緣關(guān)系的主坐標(biāo)分析

對30份國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源的ISSR標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析；30份國外引進(jìn)的辣椒材料的主坐標(biāo)二維圖和三維圖具體如圖3～4。

30 份國外引進(jìn)的辣椒材料在主坐標(biāo)二維圖排序中分為4 類（圖3）。第Ⅰ類共18 份辣椒材料，編號分別為156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180；第Ⅱ類只有編號為191 的辣椒種質(zhì)；第Ⅲ類編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亞類只有編號為167的辣椒資源。

圖1 引物807和808在30個(gè)辣椒材料中的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖譜

圖2 30個(gè)辣椒材料的ISSR聚類分析圖

圖3 30個(gè)辣椒材料的ISSR標(biāo)記的主坐標(biāo)二維散點(diǎn)圖

圖4 30個(gè)辣椒材料的ISSR標(biāo)記的主坐標(biāo)三維散點(diǎn)圖

30 份國外引進(jìn)辣椒種質(zhì)資源在主坐標(biāo)三維圖排序中分為3 類。第1 大類共18 份辣椒材料，編號分別為 156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180，這與二維圖分類一致；第2 大類共11 份辣椒材料，編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177、175和167；第3大類只有編號為191的辣椒種質(zhì)資源。

通過對圖2～4 的結(jié)果比較分析可知，主坐標(biāo)分析對30個(gè)國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行聚類和UPMGA系統(tǒng)聚類結(jié)果大體一致，部分材料略有差異；主坐標(biāo)分析能直觀、多層次和整體地反映出辣椒種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 ISSR研究辣椒的遺傳多樣性

本研究從哥倫比亞大學(xué)公布的96條ISSR引物中篩選到8 條穩(wěn)定性好的多樣性引物，這8 條ISSR 引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)為222條，平均多態(tài)條帶數(shù)為173條。已有研究者們應(yīng)用ISSR 標(biāo)記開展辣椒種質(zhì)遺傳多樣性分析，均取得了較好的成效[14-17,22-24]。學(xué)者們對辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性已有大量研究[13]，對國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究卻相對比較少[25]。筆者應(yīng)用8 條ISSR 標(biāo)記對30 份國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從構(gòu)建的遺傳相似系數(shù)和UPGMA聚類圖及主坐標(biāo)分析可知，ISSR標(biāo)記基本上可以把30份國外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)分為2個(gè)大類，其中編號分別為156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184 和180這18 份材料為一個(gè)大類，為一年生辣椒(C.annuum)；另外的12份材料為另一個(gè)大類，可能包括其他的辣椒栽培種。由上述分析可知，ISSR分子標(biāo)記在研究辣椒種質(zhì)資源鑒定分類方面是一種可行的分子標(biāo)記。

3.2 形態(tài)指標(biāo)與ISSR標(biāo)記聚類分析的比較

通過對比形態(tài)學(xué)性狀[20]和ISSR分子標(biāo)記2種聚類結(jié)果分析可知，形態(tài)學(xué)標(biāo)記與ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果絕大部分相符，基本上能把一年生辣椒聚為一類，而其他的栽培種聚為另一類，由此說明形態(tài)學(xué)聚類與ISSR分子標(biāo)記聚類具有一定的一致性。但在形態(tài)學(xué)性狀聚類分析時(shí)，編號為191的辣椒種質(zhì)資源歸為中華辣椒(C.chinense)，而在利用ISSR 分子標(biāo)記聚類分析時(shí)，編號為191 的辣椒種質(zhì)資源卻歸為一年生辣椒(C.annuum)，這可能是本研究選用的ISSR引物太少，下一步需加大ISSR引物數(shù)量。2種方法從不同的水平和角度進(jìn)行聚類，不能相互替換，只能互相結(jié)合和互相印證，以更全面闡明分析結(jié)果，更好分析辣椒種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。