陳賢真,喬建甌

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,上海200001)

2018年全球癌癥最新統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示,肺癌的發(fā)病率和死亡率目前均居惡性腫瘤中的第1位,比例分別為11.6%和18.4%[1],由于肺癌起病隱匿,且缺乏特異性癥狀,約65%的患者確診時(shí)已處于腫瘤的中晚期[2],5年生存率不足15%,因此對于肺癌高危人群,臨床上需要快速、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)及高靈敏度的篩查方法。CT的廣泛應(yīng)用雖然有效提高了肺癌的早期診斷率,但同時(shí)也存在假陽性率高、經(jīng)濟(jì)成本高以及輻射損傷的缺點(diǎn),而目前用于肺癌早期診斷的臨床生物標(biāo)志物敏感度及特異度又相對不高[3],因此,臨床上迫切需要尋找具有更高診斷價(jià)值的新型腫瘤標(biāo)志物,以提高肺癌的早期診斷率。

雙皮質(zhì)素樣激酶 1(doublecortin-likekinase 1,DCLK1)是具有兩個(gè)雙皮質(zhì)素(DCX)結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶,最初被認(rèn)為是神經(jīng)元形成和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,并具有微管聚合的功能[4]。目前累積的臨床證據(jù)支持DCLK1與腫瘤侵襲性相關(guān),并在癌癥干細(xì)胞中表達(dá),為癌細(xì)胞提供腫瘤起始能力[5],并在功能上參與多種惡性腫瘤的生長、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)及轉(zhuǎn)移過程[6],抑制DCLK1表達(dá)可促進(jìn)腫瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表達(dá)增加,使腫瘤生長停滯[7,8],并同時(shí)抑制腫瘤EMT過程[8]。然而,目前關(guān)于DCLK1在肺癌中的研究還較少,外周血DCLK1表達(dá)含量和非小細(xì)胞肺癌患者的臨床關(guān)系尚未有相關(guān)報(bào)道,鑒于DCLK1在惡性腫瘤中表現(xiàn)出來的成瘤性,因此本課題通過檢測血清中DCLK1表達(dá)水平,初步探討DCLK1與肺癌的相關(guān)性,并與CEA對比,評價(jià)DCLK1在NSCLC患者中的臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2018年1月至2018年6月經(jīng)病理及影像學(xué)確診的95例NSCLC患者靜脈血樣本,標(biāo)本獲取前患者均未接受行手術(shù)、化療及藥物治療,并排除有肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等肺部良性疾病,合并其它臟器疾病,合并自身免疫性疾病,有其它惡性腫瘤病史的患者。其中男性56例,女性39例,平均年齡(66.39±12.56)歲。肺癌的組織學(xué)分類采用2015年WHO標(biāo)準(zhǔn)[9],入組鱗癌患者39例,腺癌56例,臨床分期按照2009年IASLC公布的第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[10],共納入Ⅰ期19例,Ⅱ期16例,Ⅲ期22例,Ⅳ期38例。年齡、性別以及吸煙史差異在肺癌患者中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。另選取同時(shí)期我院62例健康體檢者作為對照組,納入對象身體狀況良好,均證實(shí)無系統(tǒng)性疾病及惡性腫瘤病史,其中男性30例,女性32例,平均年齡(55.44±9.48)歲。所有受試者于入院第2天清晨空腹采集肘正中靜脈血2 ml于EDTA管內(nèi),立即送往我院中心實(shí)驗(yàn)室,每管樣本經(jīng)高速離心后取上層血清200 μl,在-80℃下儲存?zhèn)溆?。本研究?jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn),所有受試人員均知情同意。

1.2 方法

采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清樣本中DCLK1 的含量。DCLK1 ELISA試劑盒采購于武漢伊萊瑞特生物科技公司,試劑盒檢測范圍：(0.16-10)ng/ml。采用雙抗體夾心法,操作步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。簡要步驟如下：向已包被人DCLK1抗體的96孔板中加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品,37℃孵育90 min；棄去孔內(nèi)液體,每孔加入100 μl生物素化抗體工作液,37℃孵育60 min；洗滌3次,每孔加入100 μl HRP酶結(jié)合物工作液,37℃孵育30 min；洗滌5次后加入90 μl底物溶液,37℃孵育15 min；加入50 μl終止液,立即用全自動酶標(biāo)儀(美國THERMO公司)在450 nm波長下測量各孔的光密度值(OD值),最后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算相應(yīng)的DCLK1濃度。CEA的檢測由我院檢驗(yàn)科采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者和健康組中血清DCLK1表達(dá)情況比較

NSCLC患者血清DCLK1表達(dá)水平為(6.541±3.002)ng/ml,健康組為(2.802±1.363)ng/ml,DCLK1在非小細(xì)胞肺癌組中的表達(dá)水平明顯高于健康對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(t=10.582,P<0.001,見圖1)。

圖1 肺癌患者和健康者血清中DCLK1表達(dá)水平

2.2 血清中DCLK1表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

通過對DCLK1與NSCLC患者臨床病理資料進(jìn)行比較分析,我們發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清DCLK1水平與腫瘤的大小、病理類型、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān),其中鱗癌、中晚期、中低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者中血清DCLK1表達(dá)水平分別高于腺癌、早期、高分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者,兩組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 血清中DCLK1表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 DCLK1和CEA對NSCLC患者的臨床診斷價(jià)值比較

通過ROC曲線對比分析(見圖2),結(jié)果顯示DCLK1和CEA對于區(qū)分NSCLC患者和健康者的曲線下面積(areaunderthecurve,AUC)分別為0.879(95%CI,0.817?0.925,P<0.001)和0.799(95%CI,0.728-0.859,P<0.001),面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044),DCLK1用于診斷NSCLC的最佳閾值為4.904 ng/ml?；谏鲜鼋Y(jié)果,我們進(jìn)一步分析比較了DCLK1和CEA對于早期和中晚期NSCLC的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示DCLK1和CEA診斷Ⅰ-Ⅱ期肺癌患者的AUC分別為0.747(95%CI,0.649-0.830,P<0.001)和0.653(95%CI,0.550-0.747,P=0.012),診斷Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者的AUC分別為0.939(95%CI,0.881-0.974,P<0.001)和0.885(95%CI,0.814-0.935,P<0.001),DCLK1對于早期和中晚期NSCLC患者的診斷效能均高于CEA,見表2。

圖2 A血清DCLK1、CEA診斷肺癌的ROC曲線;B血清DCLK1、CEA診斷Ⅰ-Ⅱ期肺癌的ROC曲線;C血清DCLK1、CEA診斷Ⅲ-Ⅳ期肺癌的ROC曲線

表2 DCLK1和CEA對于NSCLC患者不同臨床分期的診斷指標(biāo)評價(jià)

2.4 肺癌患者和健康者血清DCLK1表達(dá)水平與CEA之間的相關(guān)性

通過對157例NSCLC患者和健康者血清中DCLK1與CEA表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果顯示血清DCLK1與CEA表達(dá)水平之間呈線性正相關(guān)(r=0.478,P<0.001),見圖3。

圖3 血清DCLK1與CEA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

DCLK1氨基酸N末端與雙皮素(DCX)有65%的相同結(jié)構(gòu),C末端由與Ca2+/鈣調(diào)蛋白高度相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域組成,過去也被稱為DCAMKL1[4]。既往認(rèn)為DCLK1作為一種微管相關(guān)激酶,在神經(jīng)元遷移,軸突運(yùn)輸,突觸成熟和大腦發(fā)育中起重要作用。近年來有研究顯示,DCLK1表達(dá)陽性的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性[11,12],并在胰腺癌[13]、胃癌[14]、肝細(xì)胞癌[15]、食管癌[16]等多種癌癥中過度表達(dá)。Sureban等人在小鼠胰腺癌和結(jié)腸癌模型中,利用siRNA介導(dǎo)的 DCLK1 mRNA沉默效應(yīng),可使腫瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表達(dá)增加,腫瘤體積明顯縮小,并使癌基因c-MYC及KRAS的mRNA表達(dá)量降低45%[7,8]。在腎細(xì)胞癌的研究中,將腫瘤組織內(nèi)注射DCLK1單克隆抗體CBT-15后,發(fā)現(xiàn)具有明顯的腫瘤抑制效應(yīng),同時(shí)能增加腎癌細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑藥物的敏感性[17]。此外,DCLK1還能通過增加NF-κBp65蛋白表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[18],腫瘤經(jīng)歷EMT過程后,細(xì)胞間極性和基底膜消失,腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨之增強(qiáng),EMT也被認(rèn)為是腫瘤侵襲機(jī)制中重要的早期步驟[19],因此DCLK1可能通過上述多種機(jī)制影響腫瘤的形成和發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DCLK1在NSCLC患者血清中高表達(dá),且與腫瘤臨床分期、分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一般而言,腫瘤的低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性往往預(yù)示著其具有更強(qiáng)的組織侵襲性和惡性程度,不同TNM分期則與腫瘤負(fù)荷及預(yù)后相關(guān),提示DCLK1可以為評估NSCLC的生物學(xué)行為及臨床分期提供一定的參考價(jià)值。然而本課題與周美玲[20]等人的研究結(jié)果有所不同,原因可能與DCLK1在肺癌組織和外周血中的表達(dá)水平存在差異有關(guān)。國外曾有文獻(xiàn)報(bào)道,約50%的肺癌患者血清中DCLK1基因啟動子存在甲基化現(xiàn)象,并與預(yù)后不良相關(guān)[21],因此我們推測DCLK1在肺癌中的高表達(dá)或許可間接反映這一過程。在不同病理類型的比較中,我們發(fā)現(xiàn)鱗癌患者血清中DCLK1水平明顯高于腺癌,這與Tao等人在肺癌組織中的研究結(jié)果相一致[22],提示不同的病理類型可能會對DCLK1表達(dá)水平產(chǎn)生一定的影響。

通過ROC曲線分析,我們發(fā)現(xiàn)在不同臨床分期的NSCLC患者診斷中,DCLK1的ROC曲線下面積及約登指數(shù)均高于CEA,并且對于早期和中晚期患者的診斷敏感度優(yōu)于CEA,提示DCLK1用于肺癌診斷具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值,并有望成為肺癌篩查和診斷的潛在新型腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,外周血中DCLK1表達(dá)水平在NSCLC患者中存在明顯的腫瘤相關(guān)性,并且DCLK1在NSCLC診斷上具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值,檢測外周血DCLK1水平可以為患者的病情評估及腫瘤診斷提供一定的參考價(jià)值。由于本研究的樣本量較少,今后尚需擴(kuò)大臨床病例數(shù)來進(jìn)一步評價(jià)DCLK1對肺癌診斷的價(jià)值,未來還可進(jìn)一步設(shè)計(jì)前瞻性研究,探討外周血DCLK1表達(dá)水平與肺癌患者生存期及預(yù)后的關(guān)系。