陳文娟,雷光焰,趙 征,雷寶霞,韓 樂(lè)*

(陜西省腫瘤醫(yī)院 1.內(nèi)三科;2.胸外科,陜西 西安710061)

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示:肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位[1]。小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)約占肺癌發(fā)病率的14%,具有高度侵襲性,約60%患者就診時(shí)已是廣泛期[2]。約70%的患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)化療反應(yīng)較好,但不可避免的復(fù)發(fā),二線(xiàn)治療有效率有限,2年的總生存小于5%[3,4]。免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑在SCLC治療中仍在探索階段[5]。因此,深入研究SCLC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制至關(guān)重要。

DKK1是Wnt信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控因子,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6]。MMP2和MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員,在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程有重要作用。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及小細(xì)胞肺癌的特征,猜測(cè)DKK1和MMPs可能與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。為進(jìn)一步證實(shí),本課題組采用慢病毒感染的方法穩(wěn)定下調(diào)SBC-5細(xì)胞中DKK1的表達(dá),觀察下調(diào)DKK1表達(dá)對(duì)SBC-5細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響,并對(duì)分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料人小細(xì)胞肺癌SBC-5細(xì)胞株凍存于實(shí)驗(yàn)室液氮罐、PCR引物由上海生工設(shè)計(jì)合成、DKK1、MMP2和MMP9抗體(兔抗人)購(gòu)自Abcam 公司、β-actin(鼠抗人)抗體購(gòu)自Sigma 公司、慢病毒由吉?jiǎng)P公司合成,其余常用試劑及儀器為實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)SBC-5細(xì)胞復(fù)蘇、重懸,于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代,擴(kuò)大培養(yǎng),后續(xù)實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 構(gòu)建DKK1表達(dá)下調(diào)的SBC-5細(xì)胞株處理細(xì)胞,調(diào)整密度為1×104/ml,6孔版每孔加入2 ml細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24 h,密度達(dá)20%且狀態(tài)良好時(shí)換為無(wú)血清培養(yǎng)基,取DKK1過(guò)表達(dá)慢病毒及相應(yīng)對(duì)照病毒,分別在含有Polybrene的ENi.S感染液中進(jìn)行感染?；虬行蛄?GAACCACCTTGTCTTCAAA。感染24 h更換成完全培養(yǎng)基,72 h觀察細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光的比例,大于80%提示感染成功。擴(kuò)大培養(yǎng),加入1 μg/ml嘌呤霉素篩選1周。

1.4 RT-PCR和Western-bloting方法鑒定SBC-5-DKK1-siRNA細(xì)胞株構(gòu)建成功① RT-PCR: 按照操作步驟進(jìn)行RNA提取,測(cè)定濃度和純度。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR,β-actin作為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計(jì)算結(jié)果。② Western-bloting:冰上裂解細(xì)胞30分鐘,提總蛋白,定量并制備蛋白樣品；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%BSA室溫封閉1 h,1×TBST 洗滌3次,每次15 min,BSA稀釋的1∶2000 DKK1和1∶ 8000 β-actin一抗4℃過(guò)夜雜交,洗滌方法同上,1∶2000稀釋的二抗室溫雜交1 h,同上洗滌;ECL顯影、曝光。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度調(diào)整為2×103/ml,6孔版每孔100 μl細(xì)胞懸液,培養(yǎng)液補(bǔ)至2 ml,常規(guī)培養(yǎng)。肉眼可見(jiàn)克隆形成時(shí)終止培養(yǎng),預(yù)冷PBS洗3次,甲醇固定15 min,結(jié)晶紫染液染色20 min,自來(lái)水沖洗,空氣干燥。肉眼計(jì)數(shù)可見(jiàn)克隆數(shù),計(jì)算克隆形成率:克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。重復(fù)3次。

1.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜,室溫風(fēng)干；無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,密度調(diào)整為5×104/ml,取200 μl/孔加入含8 μm孔徑膜的Transwell上室,下室加入500 μl完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。拿出小室,淋洗及染色步驟同平板克隆實(shí)驗(yàn),計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù),隨機(jī)取10個(gè)視野,取平均值。重復(fù)3次。

1.7 Western-bloting法檢測(cè)MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟同上所述。一抗為1∶2000 MMP2、MMP9和1∶ 8000 β-actin。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)DKK1表達(dá)的SBC-5-DKK1-siRNA細(xì)胞株的構(gòu)建

感染72 h觀察兩組細(xì)胞熒光率大于80%(圖1),且形態(tài)良好,提示感染成功。

圖1 倒置熒光顯微觀察慢病毒感染SBC-5細(xì)胞后兩組細(xì)胞的形態(tài)及熒光,可見(jiàn)感染效率大于80%

2.2 下調(diào)DKK1表達(dá)的SBC-5-DKK1-siRNA細(xì)胞株的鑒定

RT-PCR和Western-bloting方法驗(yàn)證感染效率。結(jié)果提示:實(shí)驗(yàn)組中DKK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(圖2A,B)。

2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞克隆形成的數(shù)目,計(jì)算克隆形成率,結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組為(0.11±0.01),低于對(duì)照組(0.20±0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0097)(圖3A,B)。

2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

計(jì)數(shù)穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù):每高倍視野(×200)下實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)為58.67±6.01,對(duì)照組為158± 6.56(圖4A,B),兩組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0059) 。

2.5 Western-bloting檢測(cè)兩組細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)差異結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)均被抑制(圖5)。

圖2 兩組細(xì)胞中DKK1mRNA和DKK1蛋白的表達(dá)(*P<0.05)

A:下調(diào)DKK1表達(dá)對(duì)SBC-5細(xì)胞克隆形成能力的影響；B:實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析( *P<0.05)

A:Transwell 檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力變化;B:侵襲能力統(tǒng)計(jì)分析(*P<0.05)

圖5 Western-bloting法檢測(cè)下調(diào)DKK1后兩組細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的差異

3 討論

Wnt信號(hào)通路被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)[7]。DKK1是DKKs家族中的一員,屬于分泌型蛋白。通過(guò)與Wnt受體LRP5/6及跨膜蛋白Kremen1/2結(jié)合形成三聚體,誘導(dǎo)其內(nèi)吞而發(fā)揮抑制Wnt信號(hào)通路的作用[8]。

DKK1被報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株C4-2B 中過(guò)表達(dá),通過(guò)抑制Wnt通路引起骨溶解的增加[9,10]。DKK1在NSCLC患者血清水平和細(xì)胞株中表達(dá)升高,尤其是骨轉(zhuǎn)移者[11]。盡管DKK1被報(bào)道與多種惡性腫瘤相關(guān),但在SCLC中的研究仍較少。結(jié)合文獻(xiàn)及SCLC易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),猜想DKK1可能在小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。我們選取具有高增值能力及轉(zhuǎn)移能力的BC-5細(xì)胞,下調(diào)DKK1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖及侵襲能力被抑制。提示DKK1對(duì)SBC-5細(xì)胞的生物學(xué)行為均有影響。初步揭示DKK1可能參與了SCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

DKK1對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控較為復(fù)雜[12]。為初步探討DKK1影響SBC-5細(xì)胞株的機(jī)制,我們檢測(cè)下調(diào)DKK1表達(dá)后MMP2和MMP9的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9的表達(dá)均被抑制,初步揭示DKK1可能通過(guò)MMP2和MMP9在SCLC中發(fā)揮作用。MMP2和MMP9參與了腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程,特別是在新生血管的形成中發(fā)揮著重要的作用[13]。Maniotis等人發(fā)現(xiàn)在高侵襲性葡萄膜黑色素瘤中,存在血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)現(xiàn)象[14],MMP2和MMP9被稱(chēng)為VM相關(guān)蛋白。Lingli Yao等[15],在高表達(dá)DKK1和低表達(dá)DKK1的NSCLC細(xì)胞株A549和H460中,分別下調(diào)和上調(diào)DKK1表達(dá),觀察到下調(diào)DKK1表達(dá)后VM相關(guān)蛋白MMP2及MMP9表達(dá)均被抑制,上調(diào)組結(jié)果相反。本實(shí)驗(yàn)在SBC-5細(xì)胞株中的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。提示DKK1可能通過(guò)MMP2和MMP9影響小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了DKK1對(duì)SBC-5細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響,同時(shí)揭示DKK1可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管擬態(tài)相關(guān)蛋白MMP2和MMP9的表達(dá)在小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮生物學(xué)功能。為后續(xù)深入研究DKK1在人SCLC中的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。