于 鑫,盧發(fā)強,宗成國,張衛(wèi)軍,牟 銳,魏丹冰,范世珍,于波海*

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連116001；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院)

姜黃素(curcumin)是從植物姜黃根莖中提取的天然多酚化合物,是姜黃能發(fā)揮藥理學(xué)作用的主要成分[1]。大量研究表明姜黃素具有多種生物學(xué)功能,包括抗氧化、抗炎及抗腫瘤等特性。姜黃素可通過選擇性的細(xì)胞毒性對多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗瘤效應(yīng),例如,抑制結(jié)腸癌和肺癌的腫瘤細(xì)胞增殖,減緩乳腺癌和肝癌等的發(fā)展,在腫瘤的臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[2,3]。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)大分子和細(xì)胞器降解和循環(huán)利用的分解代謝過程,普遍存在于真核細(xì)胞中。自噬是細(xì)胞在不利存活的環(huán)境中為保持細(xì)胞完整性的生存機制,同時也可作為細(xì)胞死亡的一種方式,稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是骨髓惡性增殖性疾病,約有95%的病例有骨髓細(xì)胞的克隆性增殖,其特征是包含Ph染色體,導(dǎo)致BCR-ABL融合蛋白的產(chǎn)生[3,4]。

研究顯示姜黃素對于腫瘤細(xì)胞的主要毒性作用是凋亡,自噬可能在腫瘤的發(fā)展過程中起到雙重作用：促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的死亡[4]。本課題以CML細(xì)胞系K562細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?研究姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬在抗瘤過程中的作用,為臨床治療提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

K562細(xì)胞購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。

1.2 藥物與試劑

姜黃素,3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA),噻唑藍(lán)(MTT),二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基,青-鏈霉素抗菌液購自美國GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自以色列Biological Industries公司；TRIzol試劑購自美國Life Technologies公司；cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；Wsetern Blotting ECM增強顯色法檢測試劑盒,SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠LC3 IgG,Beclin1 IgG購自日本MBL公司；GAPDH內(nèi)參抗體購自北京中杉金橋公司；蛋白質(zhì)定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。姜黃素溶于DMSO,制成10mM儲存液,避光保存?zhèn)溆?。實驗中對照組DMSO的終濃度均<0.1%。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀,垂直電泳槽,轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Bio-Rad公司)；MCO-17A1二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；Heal Force生物安全柜(上海力申公司)；7500型qPCR儀(美國ABI公司)；5700型PCR儀(美國ABI公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細(xì)胞,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,每2-3天傳代一次。

1.4.2MTT實驗檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔2×104個細(xì)胞接種于96孔板,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清后,分別加入含5 μM,10 μM,20 μM,40 μM姜黃素的培養(yǎng)液,在培養(yǎng)12 h,24 h,48 h,72 h后棄上清,每孔加MTT(5 mg/ml)溶液20 μl,37℃培養(yǎng)4 h。離心后棄上清,每孔加150 μl DMSO,震蕩10 min后,用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定每孔的吸光度值。抑制自噬需加入2.5 mM 3-MA預(yù)處理3 h,再進(jìn)行后續(xù)實驗。設(shè)置對照組(<0.1%DMSO),空白對照組(不含細(xì)胞),實驗組與對照組均設(shè)3個重復(fù)孔。細(xì)胞生存率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)×100%,生長抑制率=1-細(xì)胞生存率。

1.4.3Western blot實驗檢測自噬相關(guān)蛋白

K562細(xì)胞分別與0 μM,10 μM,20 μM,40 μM姜黃素共培養(yǎng)48 h,抑制自噬需加入2.5 mM 3-MA預(yù)處理3 h。收集2×106個細(xì)胞,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min。利用Bradford對蛋白濃度進(jìn)行定量,獲取20 μg蛋白加入到12%SDS-PAGE的凝膠中進(jìn)行電泳,內(nèi)參選用GAPDH。電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)印至經(jīng)甲醇浸泡過30 s的PVDF膜上,用5%的BSA室溫下封閉1 h,加入一抗孵育12 h,洗膜后二抗孵育,電化學(xué)發(fā)光顯影分析。

1.4.4實時定量PCR檢測BCR-ABL融合基因

K562細(xì)胞以每孔2×106個細(xì)胞接種于6孔板,分別設(shè)置對照組(<0.1%DMSO),3-MA(2.5 mM)處理組,姜黃素(40 μM)處理組,自噬抑制組(姜黃素與3-MA),培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞,TRIzol提取總RNA,1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR反應(yīng)總體積為15 μl,包括Mix7.5 μl,BCR-ABL上游引物1.5 μl,BCR-ABL下游引物1.5 μl,TaqMan探針1.5 μl,cDNA0.5 μl,去離子水2.5 μl。反應(yīng)條件為95℃,10 min 1個循環(huán)；95℃,15 s和60℃,1 min 40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,對目標(biāo)序列進(jìn)行定量分析。

1.4.5統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以mean±SEM表示,組間比較進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制K562細(xì)胞增殖

K562細(xì)胞與不同濃度的姜黃素培養(yǎng)不同的時間,結(jié)果如圖1所示,姜黃素對K562細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,且呈劑量與時間的依賴關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與20 μM和40 μM姜黃素培養(yǎng)48 h,生存率顯著降低,因此后續(xù)實驗采用48 h作為時間點。

圖1 不同濃度姜黃素對K562細(xì)胞增殖的作用

**P<0.01

2.2 姜黃素誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬

Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ,結(jié)果顯示,隨著姜黃素濃度的增加,Beclin1和LC3-Ⅱ的表達(dá)逐漸增強(圖2A),同時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值逐漸升高(圖2B)。結(jié)果表明姜黃素可誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖2 (A)Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá) (B)不同濃度姜黃素對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響

2.3 3-MA抑制自噬降低姜黃素對K562細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測不同處理組細(xì)胞增殖情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,姜黃素處理組的細(xì)胞增殖明顯降低,3-MA處理組的細(xì)胞增殖變化不大；與姜黃素處理組相比,自噬抑制組的細(xì)胞增殖顯著提高(圖3A)。Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白的結(jié)果顯示,與姜黃素處理組相比,自噬抑制組的 Beclin1和LC3-Ⅱ的表達(dá)減弱,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值降低(圖3B)。結(jié)果表明3-MA可通過抑制自噬來降低姜黃素對K562細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3 (A)不同處理組的細(xì)胞增殖情況 (B)不同處理組的自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)情況

2.4 姜黃素下調(diào)K562細(xì)胞的BCR-ABL融合基因表達(dá)

qPCR檢測BCR-ABL融合基因表達(dá),結(jié)果如圖4所示,與對照組相比,姜黃素處理組BCR-ABL mRNA的水平明顯降低；與姜黃素處理組相比,自噬抑制組的BCR-ABL mRNA水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明姜黃素可通過自噬抑制BCR-ABL融合基因的表達(dá)。

3 討論

姜黃素是一種天然的生物活性化合物,在一些國家作為食用香料和傳統(tǒng)藥物已經(jīng)應(yīng)用了幾個世紀(jì)。姜黃素具有多種藥理學(xué)作用,例如,抗炎癥、抗凝血、抗氧化、清除自由基、抗動脈粥樣硬化等。大量研究表明,姜黃素可對多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤動物模型表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖及促凋亡效應(yīng),日常服用姜黃素可提高機體的抗癌能力且安全易吸收[2,4]。有文獻(xiàn)報道,成人每天攝入4 g姜黃素可降低結(jié)腸癌的發(fā)生率[5]。在腫瘤治療的過程中,姜黃素作為天然物質(zhì)較其他化療藥物更安全,更易進(jìn)行生物降解且抗藥性更小[6]。以上特性均表明姜黃素作為安全有效的抗腫瘤藥物在臨床治療中具有較高的應(yīng)用價值。

圖4 qPCR檢測不同處理組的BCR-ABL融合基因表達(dá)水平

CML是一種造血干細(xì)胞腫瘤,表現(xiàn)為髓系細(xì)胞的進(jìn)行性增多及其在血液和骨髓中的聚集,其細(xì)胞學(xué)特征是位于22號染色體上的bcr基因與位于9號染色體上的c-abl基因易位融合,形成費城(Ph)染色體[3,5]。融合基因表達(dá)的BCR-ABL蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的融合蛋白,可激活多種下游通路導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖,失去粘附作用,影響細(xì)胞分化及抑制程序性細(xì)胞死亡[7]。雖然以融合蛋白為目標(biāo)的靶向治療藥物可有效治療CML,但細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生促使人們對抗藥性更小的植物成分化合物展開了廣泛的研究。

姜黃素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要作用機制是凋亡,自噬在姜黃素引起的細(xì)胞死亡中扮演何種角色并不十分清楚。我們的研究以K562細(xì)胞為對象,分別與不同濃度的姜黃素培養(yǎng)不同的時間,檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示,姜黃素可以劑量和時間的依賴方式明顯抑制K562細(xì)胞的增殖。為了明確自噬是否參與了姜黃素抑制細(xì)胞增殖的過程,我們加入自噬特異性抑制劑3-MA作為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與姜黃素處理組相比,自噬抑制組的細(xì)胞生存率顯著提高,說明自噬抑制了細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步證實姜黃素誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生自噬,我們檢測了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Beclin1是構(gòu)成自噬泡的必需成分,它的水平可以反映自噬是否發(fā)生。在自噬過程中,LC3的胞質(zhì)型(LC3-Ⅰ)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?LC3-Ⅱ),成為自噬體的一部分。所以,Beclin1和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ是用來評價自噬的標(biāo)志[4]。Western blot結(jié)果表明,與姜黃素處理組相比,自噬抑制組的Beclin1表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比值明顯降低,說明姜黃素確實誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生了自噬。

有文獻(xiàn)報道,三氧化二砷可通過自噬降低BCR-ABL融合蛋白的表達(dá)水平,抑制自噬可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)[8]。在我們的研究中,通過實時定量PCR檢測姜黃素誘導(dǎo)自噬對BCR-ABL融合基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,姜黃素可有效降低BCR-ABL融合基因的表達(dá)水平,而加入3-MA可抑制這種效應(yīng),說明姜黃素可以通過自噬調(diào)節(jié)BCR-ABL融合基因的表達(dá)。

盡管作了大量的研究,姜黃素抗瘤的具體分子機制仍不清楚。姜黃素的主要細(xì)胞毒性作用是凋亡,但凋亡與自噬之間具有復(fù)雜的聯(lián)系,可能相互影響與促進(jìn)。目前認(rèn)為,姜黃素可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路的相關(guān)基因表達(dá)來發(fā)揮抗瘤作用,如NF-κB,蛋白激酶B(AKT),有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK),p53等[9]。有研究表明,姜黃素作用于K562細(xì)胞,可使BAX和生存素持續(xù)表達(dá),同時損害抗凋亡蛋白BCL-2和XIAP,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡性死亡[3]；姜黃素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗瘤作用[4]；姜黃素與K562細(xì)胞共培養(yǎng),可導(dǎo)致PTEN的水平升高,AKT的磷酸化以及VEGF的表達(dá)和釋放降低,通過升高細(xì)胞內(nèi)的miR-196b水平來下調(diào)BCR-ABL的表達(dá)[7]。

綜上所述,我們的研究結(jié)果表明,姜黃素可通過誘導(dǎo)自噬下調(diào)BCR-ABL融合基因的表達(dá)水平并抑制K562細(xì)胞增殖。在之后的工作中,我們將著手研究姜黃素發(fā)揮抗瘤效應(yīng)的可能分子機制以及在此過程中凋亡與自噬的相互作用,進(jìn)一步為CML的臨床治療提供理論依據(jù)。